一种多功能GLP-MnO2纳米酶通过清除活性氧（ROS）以及双模式MRI/PAI引导的成像技术来抑制TGF-β1/Smad信号通路，从而用于治疗肝纤维化

《Biomaterials Advances》：A multifunctional GLP-MnO 2 nanozyme suppresses TGF-β1/Smad signaling through ROS scavenging and dual-modality MRI/PAI-guided imaging for treating liver fibrosis

肝纤维化的治疗机制与GLP-MnO?纳米酶研究

　　

纪慧芳|霍元清|姜璐|文超超|郭艾伦|苗兰兰|李云兰|李婷婷

山西医科大学药学院，太原，030001，中国

摘要

肝纤维化主要表现为氧化应激和过量的细胞外基质沉积，是严重的健康负担。TGF-β1/Smad通路的激活是这一过程的核心驱动因素。不幸的是，目前的肝纤维化临床治疗方法都存在一定的局限性，这突显了开发新型治疗方法的紧迫性。在本研究中，灵芝多糖（GLP）-MnO₂纳米酶主要通过两种机制治疗肝纤维化：首先，它具有强大的抗氧化酶活性，如过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD），能够有效清除纤维化肝区的超氧阴离子（·O₂^?）、过氧化氢（H₂O₂）和羟基自由基（·OH），从而减轻氧化应激；其次，它能够抑制TGF-β1/Smad通路的激活。因此，胶原蛋白I、α-SMA以及炎症介质TNF-α、IL-6和IL-1β的生成量减少。此外，这种纳米酶还具有被动肝靶向性和双模态光声成像（PAI）及磁共振成像（MRI）特性，为肝纤维化的治疗干预和疾病评估提供了重要支持。总体而言，这些结果展示了GLP-MnO₂纳米酶在治疗肝纤维化方面的潜力。

引言

肝纤维化是慢性肝损伤后异常组织修复的常见病理结果，其特征是瘢痕组织的形成和过量的细胞外基质（ECM）沉积[1]。这一过程主要是由肝星形细胞（HSCs）持续激活引起的，这些细胞会转化为肌成纤维细胞并合成大量胶原蛋白（主要是I型和III型），从而破坏正常的肝脏结构和功能[2]。全球范围内，肝纤维化的病因多种多样，主要包括酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）以及由病毒引起的慢性乙型或丙型肝炎感染。随着肥胖和代谢综合征的流行，NASH的发病率正在迅速增加，成为终末期肝病的主要原因[3]。如果不进行治疗，肝纤维化可能会发展为肝硬化、肝衰竭甚至肝细胞癌，对全球公共卫生构成严重威胁。

在肝纤维化的复杂发病机制中，活性氧（ROS）的过度积累和TGF-β1/Smad信号通路的激活是两个相互促进的核心驱动因素[4]。慢性肝损伤会导致线粒体功能障碍和NADPH氧化酶等酶系统的过度激活，引发ROS的爆炸性积累[5]。高水平的ROS不仅直接诱导肝细胞凋亡和坏死，还作为关键的第二信使激活HSCs并维持其激活状态[6],[7],[8]。同时，TGF-β1被认为是最强的促纤维化因子。它磷酸化Smad2/3，与Smad4形成复合物并转移到细胞核中，直接上调与纤维化相关的基因表达，包括胶原蛋白和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）[9]。值得注意的是，ROS和TGF-β1/Smad通路之间存在密切的相互作用：ROS会氧化修饰TGF-β信号通路中的负调节因子，从而放大Smad信号；相反，激活的TGF-β通路会进一步促进ROS的生成，形成一个正反馈循环，驱动HSCs的持续激活和ECM的沉积[10]。因此，开发同时清除ROS和抑制TGF-β1/Smad通路的策略对于有效阻止肝纤维化的发展至关重要。

此外，肝细胞缺氧也是肝纤维化的重要诱因。缺氧会介导慢性炎症反应和细胞外ECM的异常沉积，从而推动肝纤维化的进展。随着纤维化的进展，肝窦的毛细血管化加剧，进一步加重肝脏的缺氧，形成一个自我持续的恶性循环[11]。近年来，产氧材料已被证明能够有效提高病变组织的局部氧水平[12]。因此，利用这类材料来缓解肝脏缺氧有望成为减轻肝纤维化的有效策略。

目前，肝活检是肝纤维化临床诊断的金标准。然而，由于其侵入性、取样误差、观察者间差异以及无法提供实时动态监测等固有缺点，其应用受到限制[13]。基于超声波、CT和MRI的非侵入性诊断技术有效克服了传统检测方法的局限性。其中，MRI由于其无辐射、深部组织穿透能力、高空间分辨率和出色的软组织对比度，已成为肝纤维化非侵入性诊断的关键工具[14]。目前，已经出现多种创新的基于MRI的诊断策略。例如，针对肝纤维化早期阶段活化HSCs表面高表达的纤维细胞活化蛋白（FAP），研究人员成功构建了特定的小分子MRI探针。这些探针在FAP的催化下进行原位自组装，显著提高了其弛豫率，实现了对纤维化区域的敏感磁共振成像[15]。另一方面，通过设计对I型胶原蛋白具有强亲和力的钆-钯纳米簇（GPPGL），实现了探针在肝纤维化区域的靶向积累。MRI信号增强的程度与纤维化的进展相关，为非侵入性评估肝纤维化严重程度提供了新方法[16]。在治疗方面，除了针对病因的治疗（如抗病毒治疗）外，目前全球尚无药物被批准用于特异性逆转肝纤维化，临床治疗选择极为有限[17]。许多在临床前研究中显示前景的抗纤维化药物在临床试验中反复遇到挫折，原因包括靶向性差、全身毒性、生物利用度低以及单一靶点干预效果有限。纳米技术为肝纤维化的检测和治疗带来了新的希望，但不同的纳米材料系统各有局限性。无机纳米材料（如介孔二氧化硅、金纳米棒）通常生物降解性较差，存在长期体内毒性的风险[18]；固体脂质纳米颗粒具有良好的生物相容性，但可能存在药物泄漏、稳定性不足和在病变肝脏中富集效率低等问题[19]；聚合物纳米颗粒的降解产物可能引发炎症反应，其靶向修饰策略也较为复杂[20]。纳米酶作为纳米材料的一个子集，相比天然蛋白酶具有显著优势，如更优异的稳定性、耐高温、极端pH值和有机溶剂的能力，以及能够同时模拟多种天然酶的功能[21]；通过表面工程显著增强了活性，具有可控的酶样活性[23]。其中，碳点纳米酶广泛应用于炎症和氧化应激相关疾病[24]，而铈纳米酶已被用于治疗炎症性肠病和急性肝损伤[25],[26]。相比之下，MnO₂纳米酶除了具有类似SOD和CAT的抗氧化酶活性外，还具有独特的优势[27],[28]。首先，MnO₂纳米酶具有产氧特性。在肝纤维化的炎症微环境中，MnO₂纳米酶可以催化H₊和H₂O₂之间的反应，生成O₂和Mn²⁺，有效缓解纤维化肝组织的缺氧，生成的Mn²⁺可作为体内多种酶反应的天然辅因子，表现出高生物安全性[29]。其次，MnO₂纳米酶具有双模态MRI和PAI成像能力，有助于评估其对肝纤维化的治疗效果[30]。总之，MnO₂纳米酶通过多种协同机制对抗肝纤维化：一方面，其抗氧化酶活性有效清除纤维化肝脏中的ROS；另一方面，其产氧功能缓解局部组织缺氧，从而抑制缺氧引起的纤维化进展。此外，MnO₂纳米酶结合了双模态MRI/PAI成像能力，实现治疗过程的实时可视化监测和疗效评估，实现了诊断与治疗的真正整合。

GLP作为一种天然多糖，具有优异的生物相容性和非免疫原性。它们可以通过酶解转化为单糖，在体内完全代谢，表现出强大的抗氧化、抗炎和保肝作用。与MnO₂纳米酶结合使用时，可以产生强大的协同效应，清除ROS并抑制TGF-β1/Smad信号通路[31],[32]。

本研究成功开发了一种新型GLP-MnO₂纳米酶。我们利用GLP表面的丰富羟基与MnO₂纳米酶表面的氧原子形成氢键，使两者相互吸引并结合。通过GLP修饰，提高了MnO₂纳米酶的水溶性。在病变区域，GLP-MnO₂同时表现出类似CAT和SOD的活性，有效清除积累的ROS，从而打破氧化应激的恶性循环。同时，它通过减少ROS引起的TGF-β1/Smad通路的激活，抑制HSC的激活和增殖，最终减少异常ECM的沉积（图1）。本研究将系统评估GLP-MnO₂纳米酶的合成和表征、体外ROS清除性能、双模态成像能力以及在体内肝纤维化模型中的治疗效果。还将阐明其通过“清除ROS-抑制TGF-β1/Smad通路”途径发挥治疗作用的分子机制。目的是提供一种具有诊断和治疗功能的新型纳米酶候选药物，用于肝纤维化的评估和管理。

GLP-MnO₂纳米酶的制备

MnO₂纳米酶的制备主要遵循先前建立的方法。简要来说，将0.246 mol尿素（CO(NH₂)₂和1.8 mmol硫酸锰（MnSO₄）溶解在15 mL纯水中。然后缓慢加入6 mL 0.2 mol/L高锰酸钾（KMnO₄），并在适宜温度下静置24小时。离心收集固体产物，用乙醇和蒸馏水洗涤三次，然后在60°C下空气中干燥12小时

GLP-MnO₂纳米酶的合成与表征

图1A展示了GLP-MnO₂纳米酶的合成方法。简要来说，将KMnO₄逐滴加入MnSO₄和CO(NH₂)₂的混合物中，然后在室温下静置孵育24小时。经过离心和洗涤步骤后，获得MnO₂纳米酶。随后，将GLP与MnO₂纳米酶结合，生成GLP-MnO₂纳米酶。这种纳米酶主要是通过MnO₂纳米酶表面的氧原子与GLP形成氢键而形成的

结论

在这项研究中，我们成功合成了GLP-MnO₂纳米酶，并将其应用于肝纤维化的管理。首先，我们使用SEM、DLS、zeta电位、TGA、FTIR、XPS和XRD对GLP-MnO₂纳米酶进行了表征，确认了其成功合成，并详细了解了其形态、粒径和电学性质。不同浓度的GLP-MnO₂纳米酶的MRI和PAI研究表明了其双模态成像的潜力。

作者贡献声明

纪慧芳：撰写初稿、概念构思、数据管理、数据分析、方法学研究、可视化、审稿与编辑。霍元清：撰写初稿、数据管理、概念构思、数据分析、方法学研究、可视化、审稿与编辑。姜璐：撰写初稿、数据管理、数据分析、方法学研究。文超超：撰写初稿、数据管理、数据分析、可视化。郭艾伦：撰写初稿

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了山西省自然科学基金（编号202503021211138）和山西医科大学慢性肾脏病医学基础研究创新中心（编号CKD/SXMU-2025-04和CKD/SXMU-2024-11）的特殊资助，以及山西省高等教育“百亿工程”科技指导项目（编号IDD/SXMU-2024-01）的支持。

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