茯苓多糖-蜂窝状二氧化锰纳米颗粒佐剂通过TLR4介导的NF-κB激活增强STING通路，从而增强对PCV2疫苗的免疫反应

《Biomaterials Advances》：Poria cocos polysaccharide-honeycomb manganese oxide nanoparticles adjuvant enhanced immune responses to PCV2 vaccine via TLR4-mediated NF-κB activation enhanced STING pathway

PMn纳米颗粒通过激活TLR4-NF-κB和cGAS-STING通路促进树突状细胞活化，增强PCV2疫苗的体液和细胞免疫应答，诱导germinal center形成和记忆T细胞响应。

　　

徐盼盼|杨润宇|赵琪|张子烨|朱一轩|王桥|王伟|刘鹏|史婉瑜|顾鹏飞

河北农业大学传统中医兽医学院，保定，071001，中国

摘要

佐剂作为疫苗中不可或缺的成分，具有增强免疫反应的强度、广度和持久性的能力。传统的明矾佐剂主要能引发强烈的体液免疫反应，但无法有效刺激细胞免疫反应。我们之前成功制备了灵芝多糖-蜂窝状氧化锰纳米颗粒（PMn）系统，该系统能够促进树突状细胞（DCs）的活化并增强免疫反应。在此研究中，我们进一步探讨了DCs活化的潜在机制，并研究了PMn作为猪圆环病毒2型（PCV2）疫苗佐剂的潜力。研究发现，PMn通过TLR4-NF-κB和cGAS-STING途径促进了DCs的活化。TLR4介导的NF-κB活化能够进一步增强STING的活化。此外，作为PCV2疫苗的佐剂，PMn促进了DCs的活化以及淋巴结中生发中心的形成，激发了强烈的体液和细胞免疫反应，诱导了高效且平衡的抗体产生，并刺激了有效的抗原特异性T细胞反应。总体而言，PMn佐剂可能为开发能够引发先天性和适应性免疫反应的基于多糖和锰的纳米颗粒佐剂提供有价值的见解，具有在人类和兽医疫苗中的应用潜力。

引言

疫苗是预防和控制人类和动物多种疾病最普遍和最有效的方法[1]，[2]。佐剂作为疫苗中不可或缺的成分，能够引发持久且有效的免疫反应或改变所触发的免疫反应类型[3]，[4]。在人类和兽医疫苗中，明矾佐剂主要引发Th2型体液免疫反应，而刺激Th1型细胞免疫反应的能力较弱[5]，[6]，[7]。然而，针对细胞内病原体的保护性免疫通常需要Th1型细胞免疫反应[6]，[7]。因此，迫切需要研究新型和全面的佐剂以开发现代疫苗。

许多研究表明，来自传统中医的天然多糖具有强大的免疫刺激作用，同时具有生物相容性、多样性和安全性，因此在疫苗佐剂的应用中具有广阔前景[8]，[9]，[10]。天然多糖可以激活多种信号通路，如TLR2/4介导的信号转导通路，从而增强先天免疫和抗原特异性免疫反应[9]，[11]。此外，锰是多种生理过程的关键微量元素，如发育、繁殖、免疫调节、神经功能和抗氧化防御[12]。研究表明，锰通过促进cGAS-STING通路的活化对先天免疫的激活至关重要[12]。最近的研究表明，锰能够通过cGAS-STING途径促进树突状细胞（DCs）的活化，锰盐具有作为强效佐剂刺激体液和细胞免疫反应的潜力[13]。多项研究表明，基于锰的纳米颗粒佐剂可以在体内降解，持续释放Mn²⁺以激活cGAS-STING通路，从而引发强烈的体液和细胞免疫反应[14]，[15]，[16]，[17]。与可溶性Mn²⁺相比，基于锰的纳米颗粒更容易被巨噬细胞和DCs吸收。此外，这些纳米颗粒能够以pH敏感的方式持续释放Mn²⁺，从而达到有效的Mn²⁺浓度，从而引发持续的免疫刺激并产生更强的免疫反应[1]，[15]，[16]，[17]。

在我们之前的研究中，我们成功从灵芝中提取并纯化了一种水溶性灵芝多糖（PCP），其分子量为20.112 kDa，主要由→6)-α-D-Galp-(1→组成，含有少量→3)-β-D-Glcp-(1→和→4)-β-D-Glcp-(1→，显示出显著的免疫刺激活性[18]。同时，为了解决多糖靶向性差、半衰期短和生物利用度低的问题，我们开发了一种创新的基于多糖和锰的纳米颗粒佐剂递送系统（PCP-hMnO_x），在此文中称为PMn。在该系统中，PCP作为免疫增强剂被装载到蜂窝状氧化锰纳米颗粒（hMnO_x）上[19]。PMn具有介孔结构，能够有效吸附PCP和抗原，并具有pH敏感性、优异的生物相容性、可降解性和稳定性。此外，观察到PMn显著增强了PCP的免疫刺激活性，促进了DCs的活化，促进了DCs对抗原的摄取，并作为模型抗原OVA的佐剂诱导了强烈的免疫反应[19]。在此研究中，我们通过RNA测序分析和Western blot分析进一步探讨了PMn诱导DCs活化的潜在机制。此外，为了探索PMn作为疫苗佐剂的潜力，我们评估了PMn在猪圆环病毒2型（PCV2）疫苗中的佐剂活性。PCV2已被确定为断奶后多系统衰竭综合征的致病因子，这种疾病对全球养猪业造成了重大经济损失[20]。我们的结果表明，PMn通过TLR4-NF-κB和cGAS-STING途径促进了DCs的活化，TLR4介导的NF-κB活化进一步增强了STING的活化。作为PCV2疫苗的佐剂，PMn促进了引流淋巴结（dLNs）中DCs的活化，增强了dLNs中生发中心（GC）B细胞和滤泡辅助T（Tfh）细胞的生成，引发了强大且平衡的抗体反应，并刺激了抗原特异性CD4⁺和CD8⁺ T细胞的生成，改善了CD8⁺ T细胞的记忆反应，并促进了IFN-γ和IL-6的产生。因此，PMn佐剂作为一种新型佐剂，能够通过TLR4-NF-κB和cGAS-STING途径刺激先天性和适应性免疫反应。

节选

骨髓来源细胞（BMDCs）的制备

骨髓来源细胞（BMDCs）来源于BALB/c小鼠（雌性，6周龄），制备方法如前所述[17]，[21]，[22]，[23]。BMDCs在添加了GM-CSF（20 ng/mL）和IL-4（20 ng/mL）的RPMI-1640培养基中诱导生成。培养基每两天更换一次，7天后可以获得BMDCs。然后收集细胞用于后续实验。

RNA测序分析和RT-qPCR检测

在我们之前的研究中，hMnO_x和PMn（PCP-hMnO_x

PMn通过TLR4-NF-κB和cGAS-STING途径促进DCs活化

在我们之前的研究中，我们发现PMn增强了BMDCs共刺激分子（CD40和CD86）的上调，促进了细胞因子（TNF-α和IFN-β）的产生，从而促进了DCs的活化。值得注意的是，PMn激活DCs的能力比hMnO_x更强[19]。因此，我们假设PCP和hMnO_x之间可能存在协同作用。在这项工作中，我们首先研究了免疫激活的潜在机制

讨论

DCs作为关键的抗原呈递细胞（APCs），通过捕获、处理和向T细胞呈递抗原，在连接先天性和适应性免疫反应中起着关键作用[1]，[13]。接种疫苗后，抗原最初由APCs（如DCs）捕获和处理。随后，成熟的DCs迁移到淋巴结，并将抗原呈递给CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞和B细胞。这一过程有助于免疫系统识别和消除潜在的未来感染[6]。

结论

在本研究中，PMn佐剂通过TLR4-NF-κB和cGAS-STING途径促进了DCs的活化，其中TLR4介导的NF-κB活化增强了STING途径的刺激。作为PCV2疫苗的佐剂，PMn促进了引流淋巴结（dLNs）中DCs的活化，增强了GC B细胞和Tfh细胞的生成，引发了强大且平衡的抗体反应，并刺激了有效的抗原特异性T细胞反应。总之，PMn佐剂可能通过TLR4-NF-κB和cGAS-STING途径触发先天

CRediT作者贡献声明

徐盼盼：撰写——原始草稿，项目管理，方法学，数据分析。杨润宇：项目管理，方法学。赵琪：项目管理。张子烨：项目管理。朱一轩：项目管理。王桥：项目管理。王伟：项目管理。刘鹏：项目管理。史婉瑜：撰写——审阅与编辑，监督。顾鹏飞：撰写——审阅与编辑，撰写——原始草稿，可视化

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

本项目得到了国家自然科学基金（项目编号：32302914）、河北省科技计划：河北省中央引导地方科技专项（项目编号：236Z6603G）、河北省自然科学基金（项目编号：C2023204038）和河北农业大学人才引进研究项目（项目编号：YJ2022026）的支持。