双功能近红外荧光探针，用于H?S检测及精确的COX-2阳性癌症成像

《Bioorganic Chemistry》：Dual-functional near-infrared fluorescent probe for H 2S detection and precise COX-2-positive cancer imaging

本研究开发了一种近红外荧光探针NFA-DNP，通过靶向COX-2和响应H2S实现癌症组织的精准成像，显著提高肿瘤与正常组织的对比度，为癌症诊断提供新工具。

　　

郑飞|曾艳艳|廖叶欣|黄红莲|刘阳杰|金玲玉|陈静|钟晓琳|林佳云|吴向华|张俊峰|任文秀|詹书

中国云南省师范大学化学与化学工程学院现代分离分析及物质转化重点实验室，昆明650500

摘要

癌症对人类健康构成了巨大威胁。精确地可视化癌症对于开发新的癌症诊断技术至关重要。正常组织和癌组织之间的对比度仍然不令人满意。为应对这一挑战，我们开发了一种低毒性的近红外半花青素衍生物荧光探针NFA-DNP，该探针能够以高表达水平检测COX-2。由于2,4-二硝基苯酚基团具有响应H₂S的特性，NFA-DNP在溶液和生物环境中都能敏感且快速地检测到H₂S，并显示出显著的荧光增强效果。NFA-DNP在活细胞中表现出良好的溶酶体靶向能力。结合COX-2靶向基团尼氟米酸，NFA-DNP在COX-2阳性癌细胞和组织中的靶向性能明显优于正常组织。NFA-DNP能够在体内以高对比度区分正常组织和癌组织，表明它是一种潜在的精确COX-2阳性癌症可视化工具。

引言

癌症已成为全球范围内对人类健康的主要威胁，人们非常关注开发新的精确癌症诊断策略。近红外（NIR）荧光成像技术凭借其高选择性、高灵敏度、操作简便、快速无创分析以及原位可视化监测等优点，成为癌症成像应用中的可靠工具[1],[2],[3]。然而，NIR荧光成像在癌症检测中仍存在癌组织靶向能力差和正常组织与癌组织对比度低的主要问题[4],[5]。因此，具有优异靶向能力和高对比度成像策略的探针需求迫切。

癌症中特异性表达的蛋白质常被用作精确靶向的目标，这可以提高靶向效果[6],[7]。环氧化酶-2（COX-2）是一种重要的炎症相关酶，它在肿瘤区域或与癌症相关的细胞中以高表达水平释放到肿瘤微环境（TME）中[8]，与多种癌症类型的发病机制有关[9]。相反，正常组织中COX-2的表达水平较低或几乎不存在[10]。因此，COX-2被用作肿瘤相关成像和治疗的潜在靶点，促进了针对COX-2的药品和成像剂的发展[11],[12]。过去几十年中，已经开发出了多种用于癌症成像的COX-2靶向荧光探针，其靶向基团包括COX-2的底物花生四烯酸[13]以及抑制剂如塞来昔布（CLXB）[14]、吲哚美辛[15],[16]、罗非昔布[10],[17]和阿司匹林[18]。

大多数区分正常组织和肿瘤组织的策略基于TME与正常组织在某些参数和成分上的差异[19],[20]。作为著名的“气体信号分子”之一，H₂S或HS^?（在以下文本中统称为“H₂S”）深度参与细胞信号调节[21]，与阿尔茨海默病[22]、糖尿病[23]、心血管疾病[24]等多种疾病相关[25],[26],[27]。TME中的内源性H₂S浓度高于正常组织[28]。利用这些差异，H₂S成为肿瘤成像应用中的潜在生物标志物或靶点。因此，实时监测癌症中H₂S的动态变化具有重要意义。另一方面，H₂S在某些炎症条件下调节COX-2[29]，但H₂S和COX-2在癌症中的协同作用仍不明确。研究发现H₂S参与了癌症细胞中的COX-2相关通路，如p38 MAPK/ERK1/2-COX-2通路[30]、COX2/AKT/ERK1/2轴[31]和STAT3-COX-2信号通路[32]。因此，需要更多证据来阐明H₂S和COX-2在癌症中的关系。近年来，已经开发了许多用于监测H₂S的荧光探针[33],[34]。然而，这些探针存在发射波长短或癌组织靶向能力差的缺点，限制了其在精确癌症诊断中的生物应用[35],[36]。为了提高靶向能力，我们开发了一种基于萘二亚胺的COX-2靶向荧光探针用于H₂S检测，但其短发射波长限制了进一步的应用[37]。这些研究表明，COX-2靶向探针是癌症成像的潜在工具。此外，尼氟米酸（NFA）也被报道为COX-2的抑制剂[38]。然而，据我们所知，目前尚未有基于NFA的COX-2靶向近红外荧光探针用于癌症成像应用中的H₂S监测。

在本研究中，我们设计了一种小分子荧光探针(NFA-DNP（图1），该探针能够靶向肿瘤并对H₂S产生敏感响应，用于监测肿瘤区域的细胞内H₂S水平。探针中使用了半花青素染料作为长波长发射的NIR荧光团，以提高组织穿透深度。NFA作为COX-2靶向基团以增强癌组织靶向能力。二硝基苯酚基团作为H₂S的反应位点，通过光诱导电子转移（PET）机制抑制荧光团荧光，从而降低背景信号。在TME中高浓度的H₂S触发下，NFA-DNP表现出显著的荧光增强效果。这种多功能探针在细胞和组织中均表现出优异的H₂S选择性和靶向能力，可以轻松实现正常组织和癌组织的精确区分。

荧光探针NFA-DNP的光学性质

我们首先基于NFA-DNP的溶解性进行了初步测试，最终决定在CH₃CN–PBS（v/v = 6/4, pH 7.4, 10 mmol/L）介质中进行光谱分析以获得光谱数据。NFA-DNP在600和640 nm处的主要吸收带（图S1a）在加入NaHS（0–200 μmol/L）后发生了显著变化。同时，NFA-DNP在724 nm处的发射光谱强度增加了5.6倍（图2a），并伴随出现较大的斯托克斯位移。

结论

总结来说，我们开发了一种新型的COX-2靶向近红外荧光探针NFA-DNP，用于大鼠胶质肉瘤模型中的特异性H₂S成像。该探针以半花青素染料、二硝基苯和NFA分别作为荧光团、识别基团和COX-2靶向基团。NFA-DNP能够在溶液和活细胞中快速、高选择性地检测H₂S。由于其优异的COX-2靶向能力和H₂S响应特性，NFA-DNP能够有效区分COX-2阳性细胞和正常细胞。

CRediT作者贡献声明

郑飞：数据整理。曾艳艳：数据整理。廖叶欣：撰写初稿、软件处理。黄红莲：实验研究。刘阳杰：软件开发、数据分析。金玲玉：方法学设计。陈静：验证实验。钟晓琳：验证实验。林佳云：方法学设计。吴向华：撰写、审稿与编辑、可视化设计、概念构建。张俊峰：项目管理、资金获取、概念构建。任文秀：撰写、审稿与编辑、项目管理。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了以下机构的支持：中国国家自然科学基金（项目编号：22367024）；云南省教育厅创新团队；云南省“青年人才万人计划”基金；四川省科技计划（项目编号：2022YFS0633）；广西自然科学基金（项目编号：2024GXNSFBA010222）；中国博士后科学基金（项目编号：2025M770996）；西南医科大学临床医学计划（项目编号：2024LCYXZX21）。