《Biophysical Chemistry》：Synergistic effects of glycerol on the hydration dynamics and rheological properties of collagen
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本研究通过NMR、Raman光谱及分子动力学模拟，发现甘油通过影响胶原的水合作用改变其粘弹性，降低弹性模量并提高热稳定性，对化妆品和生物医学应用至关重要。
安贾利·C·文基特桑（Anjali C. Venkitesan）| 雅兹希尼·P·穆图拉克什米（Yazhini P. Muthulakshmi）| 尼廷·P·洛博（Nitin P. Lobo）| 南达·库马尔·拉贾（Nanda Kumar Raja）| 卡纳加萨拜·巴拉穆鲁甘（Kanagasabai Balamurugan）| N·尼沙德·法蒂玛（N. Nishad Fathima）
印度金奈600020，阿迪亚尔（Adyar）的CSIR-中央皮革研究所（CSIR-Central Leather Research Institute）无机与物理化学实验室
摘要
作为一种极性绿色溶剂，甘油被广泛用于许多化妆品和生物医学应用中。甘油通过取代胶原蛋白水合壳层中的水分子来稳定其三螺旋结构，而这些水分子直接参与通过分子间和分子内氢键维持胶原蛋白的结构。了解甘油如何影响胶原蛋白的水合动态对于优化特定应用所需的甘油比例至关重要。本研究利用核磁共振（NMR）光谱学发现，随着甘油添加量的增加，胶原蛋白中不同水分子的分裂时间（T2）延长，从而导致胶原蛋白纤维结构的松弛，这一现象通过原子力显微镜（AFM）观察得到证实。拉曼光谱学的结果进一步表明，随着甘油浓度的增加，中间态水分子减少。分子动力学模拟也支持了甘油对胶原蛋白第二层水合壳层中蛋白质水合的影响。将水合动态与流变性质联系起来表明，甘油通过降低弹性模量使胶原蛋白结构变得更柔软，并提高其热稳定性。因此，本研究强调了甘油在改变胶原蛋白水合动态方面的作用，进而影响其机械性能，这对基于胶原蛋白的化妆品和生物医学领域具有重要意义。
引言
胶原蛋白是一种基本蛋白质，在维持皮肤健康和美观方面起着至关重要的作用。它是哺乳动物细胞外基质中的主要结构蛋白，支撑着皮肤、肌腱和软骨等结缔组织的机械强度和完整性。其独特的三螺旋结构富含甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸，对水合状态非常敏感，其中结合水和自由水的比例对分子流动性、层次组织和功能性质有重要影响[1]。贝拉（Bella）等人利用X射线晶体学（XRD）研究了原胶原蛋白（tropocollagen）的水合结构，并报告称水通过氢键和羟脯氨酸（Hyp）介导的水桥稳定胶原蛋白的三螺旋结构[2]，[3]。这些水分子可能会与其他与胶原蛋白相互作用的分子竞争，从而增加它们相互作用的复杂性并影响胶原蛋白的稳定性。
甘油作为一种众所周知的生物聚合物体系中的助溶剂，以其生物相容性、无毒性以及稳定胶原蛋白基质的有效性而被广泛应用，如保湿剂、增稠剂、甜味剂和防腐剂等。长期以来，人们一直在研究甘油稳定蛋白质（尤其是胶原蛋白）的能力。彭科娃（Penkova）等人报告称，甘油通过取代氢键网络中的水分子来稳定胶原蛋白的三螺旋结构[4]，[5]。他们还提出，在同一链上相邻的羟脯氨酸残基之间形成甘油桥对于维持结构稳定性起着关键作用。库兹涅佐娃（Kuznetsova）等人报告称，糖类和多元醇（特别是甘油）可以抑制I型胶原蛋白的纤维化[6]。后续的研究也表明甘油可以减少胶原蛋白的分子聚集，将其与其他多元醇进行了比较[7]。尽管有许多实验和理论研究试图阐明甘油如何保护蛋白质结构，但这些研究主要探讨了水合状态与甘油在蛋白质表面溶剂化作用之间的联系。后来发现，通过优先水合减少蛋白质与甘油之间的接触面积，甘油可以稳定天然蛋白质结构[8]。基于这一发现，人们使用小角中子散射（SANS）、静态光散射（SLS）、广角X射线散射（WAXS）和分子动力学（MD）等技术进行了相关研究[9]，[10]，[11]。
尽管甘油对肌红蛋白、溶菌酶和其他球状蛋白质的水合动态有影响，但关于胶原蛋白水合的研究却很少。此外，了解胶原蛋白的流变性质对其在化妆品和其他应用中的使用至关重要。研究表明，不同形式的胶原蛋白的机械性质变化使其在组织工程、包装和生物医学应用中具有价值[12]，[13]，[14]，[15]。作为渗透压调节剂和增塑剂，甘油可以改变胶原蛋白基质中结合水、中间态水和自由水的分布，从而影响局部氢键网络，进而影响胶原蛋白的水合动态和整体机械行为。这种相互作用成为我们使用甘油等小分子添加剂调节胶原蛋白系统水合壳层结构和流变性能的研究重点。
在本研究中，我们利用圆二色性（CD）光谱和ATR-FTIR光谱研究了甘油对胶原蛋白构象的影响，并将这些发现与核磁共振（NMR）光谱学的水合动态研究结果进行了关联。此外，还利用拉曼光谱提供了有关胶原蛋白水合力的光谱证据。分子动力学模拟也为甘油对胶原蛋白水合壳层变化提供了支持。我们使用流变仪研究了胶原蛋白-甘油系统的机械和粘弹性性质，并利用石英晶体微天平（QCM-D）分析了各种复合材料的弹性模量。原子力显微镜（AFM）提供了甘油在不同长度尺度上对纤维形态影响的证据。
材料
实验中使用的I型胶原蛋白是从6个月大的白化大鼠（Wistar品系）中提取的。纯度≥99.5%的甘油购自印度金奈的SRL Pvt. Ltd.公司。所有实验均使用Millipore纯净水。所用化学品均为分析级。
I型胶原蛋白的提取
I型胶原蛋白来自6个月大的Wistar品系白化大鼠。从大鼠尾腱中提取的胶原纤维用0.9% NaCl溶液清洗后，再溶解在0.5 M醋酸中。
胶原蛋白二级结构的圆二色性分析
加入甘油后，利用圆二色性（CD）光谱在远紫外范围（190–260 nm）对胶原蛋白的二级结构进行了分析。图1.A显示了不同量甘油对胶原蛋白的影响。天然胶原蛋白的特征CD光谱在220 nm处显示正峰，表明多脯氨酸II（PPII）构象得以保持；在197 nm处显示负峰，证实了稳定存在的...
结论
本研究表明，甘油显著影响胶原蛋白的分子稳定性、水合动态和机械性质。虽然甘油作为原胶原蛋白结构的稳定剂可以提高其变性温度，但它也在微观层面上影响胶原蛋白的水合动态，进而直接影响宏观性质如流变特性。通过影响中间态水，甘油增强了胶原蛋白的柔韧性。
作者贡献声明
安贾利·C·文基特桑（Anjali C. Venkitesan）：撰写 – 审稿与编辑、原始稿撰写、方法学设计、实验实施、数据分析。雅兹希尼·P·穆图拉克什米（Yazhini P. Muthulakshmi）：方法学设计、实验实施、数据分析。尼廷·P·洛博（Nitin P. Lobo）：撰写 – 审稿与编辑、方法学设计、数据分析。南达·库马尔·拉贾（Nanda Kumar Raja）：方法学设计、实验实施、数据分析。卡纳加萨拜·巴拉穆鲁甘（Kanagasabai Balamurugan）：撰写 – 审稿与编辑、方法学设计、数据分析。N·尼沙德·法蒂玛（N. Nishad Fathima）：撰写 –
致谢
本工作由CSIR-CLRI项目“工业应用专用化学品”（项目编号：MMP 035201）资助。CSIR-CLRI项目编号：2155。
