《Bioorganic Chemistry》：Green manufacturing synthesis of nicotinamide mononucleotide: Pathways, catalysts, and prospects
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本文系统综述了NMN合成技术进展，重点分析酶催化合成中的多策略优化方法，包括关键酶工程、共因子再生、竞争途径调控及转运系统优化，提出整合代谢工程与发酵工艺优化的未来研究方向，为高质高效NMN生产奠定基础。
Feng Peng|Wei Ke|Xiao-Yuan Jin|Yu-Jia Xie|Ya-Ping Xue|Jian-Fen Zhang
浙江树人大学生物与环境工程学院，杭州 310015，中国
摘要
功能性辅酶是一类有机小分子辅因子，在酶催化的反应中起着至关重要的作用。它们通过与酶蛋白的短暂结合参与关键的生物过程，包括氧化还原反应、基团转移和异构化。作为维持酶活性和细胞能量代谢的重要组成部分，功能性辅酶的市场需求正在迅速增长，这一趋势受到全球人口老龄化及健康意识提高的推动。生物制造技术可以通过提高生产效率、降低成本和促进产品创新来更好地满足这一市场需求，从而为该行业注入新的活力。本文以β-烟酰胺单核苷酸（NMN）作为代表性功能性辅酶，系统地回顾了当前的辅酶合成技术现状。特别强调了在发酵和酶法合成NMN过程中应用的多策略方法，涵盖了酶的分类、辅因子再生、竞争途径调节以及运输系统的优化。提出了关键酶的筛选、工程化及应用，以及系统代谢工程和耦合发酵过程优化等跨学科研究方向，以推动辅酶生物制造的持续创新。这些努力将为辅酶产业的高质量发展奠定坚实的基础，并提升其国际竞争力。
引言
衰老及其相关的退行性疾病对全球公共卫生构成了重大挑战，这激发了人们对于延缓衰老和延长健康寿命的干预措施的极大兴趣[1]、[2]。作为重要的辅酶，NAD+是细胞能量代谢和与衰老相关的信号通路中的核心调节分子，其随年龄的增长而下降是衰老及多种退行性疾病的重要特征[3]、[4]、[5]。因此，维持NAD+水平已成为干预衰老的关键策略，而其直接前体烟酰胺单核苷酸（NMN）也受到了广泛关注[6]、[7]。
然而，高效且低成本的NMN生物制造仍然是一个主要挑战，这主要是由于关键合成酶的催化性能不足：缺乏高效、经济、可持续且可扩展的合成方法。目前的NMN生产主要依赖于传统的化学合成和微生物发酵[8]、[9]。传统的化学路线通常涉及多步骤过程，需要苛刻的反应条件（如使用有毒的氰化物试剂和大量的能量输入），并且需要大量的纯化步骤。这些限制往往导致产量较低，并且越来越不符合严格的环境法规。尽管微生物发酵使用较为温和的条件，但它也面临着自身的挑战，包括复杂的菌株工程、较长的发酵时间、低的产品产率以及昂贵的下游处理成本。总体而言，这些限制导致了效率低下和经济可行性不足。
近年来，酶法合成作为一种生产复杂天然产物和药物中间体的有前景的替代方法应运而生。这种方法具有诸多优势，包括温和的反应条件、出色的区域选择性和立体选择性、环保性、较少的合成步骤，以及与生物工程方法兼容性，便于工艺优化[10]、[11]、[12]。这些特点使得酶法合成成为一种可行且可持续的NMN高效生产途径。这种方法的成功在很大程度上取决于关键生物催化剂的鉴定、表征和工程化，以提高其催化性能、稳定性和底物耐受性，以及优化反应系统的合理设计[13]、[14]、[15]。
本文系统地综述了当前NMN研究的现状，重点关注了合成方法方面的最新进展和持续存在的挑战。在介绍了NMN的结构、生物功能和关键生物医学应用之后，我们对传统的化学合成、微生物发酵和新兴的酶法合成策略进行了深入分析和比较。在酶法合成部分，我们详细阐述了从各种前体出发的主要途径，并全面探讨了涉及的核心酶，包括蛋白质结构、催化功能、反应机制和蛋白质工程策略等方面。最后，本文对未解决的挑战进行了批判性评估，并提出了酶法NMN生产的未来研究方向。通过整合这些见解，本文旨在为NMN生物学、合成生物学、生物催化和药物科学领域的研究人员提供及时的资源和前瞻性的视角，从而有助于加速这一关键分子在健康寿命干预中的高效、可持续生产和转化应用。这些研究通过基因改造和多酶系统将NMN的产量提高到了克级，展示了代谢工程的效率。然而，依赖基因敲除和异源表达仍然存在高成本和复杂工艺等问题，大规模生产的经济效益尚未得到充分验证。
NMN的结构与功能
NMN是NAD+生物合成途径中的关键中间代谢物。其分子结构由两个关键组成部分构成（图1）：一个是烟酰胺（NAM）碱基，它是维生素B?的酰胺形式；另一个是D-核糖部分，以5′-磷酸酯的形式存在[16]。这两个单元通过β-N-糖苷键连接，赋予了NMN生物活性所需的β-异构构型。
NMN的合成方法
NMN可以通过多种方法合成，包括化学合成、微生物发酵和酶法催化[61]。化学合成可以实现大规模生产，但通常受到多步骤程序、显著的环境问题和有害试剂使用的限制。微生物全细胞发酵利用代谢工程改造的细胞工厂从可再生原料中生产NMN，在可持续性方面具有优势
NR途径中的关键酶：烟酰胺核苷激酶
NRK（EC 2.7.1.173）存在于大多数真核生物中，如酵母和人类，属于脱氧核苷激酶和核苷单磷酸（NMP）激酶超家族。在人类中，NRK有两种异构体：NRK1（UniProt: Q9NWW6）和NRK2（UniProt: Q9NPI5）[79]。NRK1在多种哺乳动物组织中表达，而NRK2主要在肌肉组织中表达[80]。NRK的晶体结构包含一个核心的五股平行β-折叠片层
关键酶的底物通道参数测量
计算了KlmNRK、EcRK、BaPRS、CpNAMPT、DrPPK等酶的多种通道参数，包括通量、瓶颈半径、通道长度和曲率（表3）。这些蛋白质内的通道或隧道是小分子进出酶活性位点的动态路径。它们的物理化学性质直接决定了酶的催化效率和特异性。其中，通量直观地反映了酶的催化能力
提高NMN生产的辅助策略
尽管NMN生物合成取得了显著进展（表4），但要实现高效、经济且环保的大规模生产仍面临多重挑战[66]、[124]。未来的研究应集中在几个关键领域，从基础科学到应用工程，以突破当前的瓶颈。
(1) 新型生物催化剂的发现和合理设计：
酶法合成的效率仍受到酶活性、稳定性和
结论
NMN作为NAD+的关键前体，在抗衰老干预和改善代谢紊乱方面显示出巨大潜力。然而，实现高效、环境可持续且经济可行的大规模生产仍然是一个核心挑战。传统的化学合成方法通常是多步骤的，并伴随着显著的环境问题，而微生物发酵方法在产量和过程控制方面仍存在局限性。近年来，
缩写
| NMN | β-烟酰胺单核苷酸 |
| NAM | 烟酰胺 |
| PRS | 核糖-磷酸二磷酸激酶 |
| NAMPT | 烟酰胺磷酸核糖转移酶 |
| PRPP | 磷酸核糖焦磷酸 |
| polyP | 无机多磷酸盐 |
| RK | 核糖激酶 |
| NR | 烟酰胺核苷 |
| NRK | 烟酰胺核苷激酶 |
| PPi | 焦磷酸 |
| R5P | D-核糖-5-磷酸 |
| PPK | 多磷酸激酶 |
| ATP | 三磷酸腺苷 |
| ADP | 二磷酸腺苷 |
| AMP | 一磷酸腺苷 |
| NAD | 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 |
| GTP | 三磷酸鸟苷。 |
CRediT作者贡献声明
Feng Peng：撰写初稿、数据可视化、概念构思。Wei Ke：数据管理、概念构思。Xiao-Yuan Jin：形式分析。Yu-Jia Xie：方法论研究。Ya-Ping Xue：资源获取、数据管理。Jian-Fen Zhang：监督、资金争取。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本工作得到了浙江树人学院人才引进项目（2024R078）、科学家分析和测试基金以及浙江树人大学（202402006）的支持。
