在低温条件下富集和应用依赖硫的反硝化微生物

《Bioresource Technology》：Enrichment and application of sulfur-dependent denitrifying microbes at low temperatures

硫氧化耦合反硝化在低温下微生物群落互作及硝酸盐积累机制研究，通过连续生物反应器多组学分析揭示10℃高效运行而5℃硝酸盐积累的关键原因在于Burkholderiaceae等低丰度功能微生物的低温适应性及其代谢互作作用。

　　

卓江 | 帕洛玛·加里多-阿马多尔 | 博兰·卡尔塔尔 | 纪国东

教育部水与沉积物科学重点实验室，北京大学环境工程系，中国北京

摘要

由于对有机物的需求较低，人们提出了将反硝化作用与硫化合物的氧化结合起来，以去除污水处理厂出水中残留的硝酸盐。然而，高纬度和高海拔地区的低温会限制这一方法的应用。多种微生物能够同时驱动完全的反硝化作用和硫化合物的氧化，但这些微生物群落如何在这种低温环境下生存并维持反硝化作用仍不清楚。在此，我们在25°C和15°C条件下富集了一组高效的硫代硫酸盐依赖型反硝化菌株，并将其接种到连续生物反应器中。即使在10°C的情况下，该反应器也表现出高效的反硝化性能，且亚硝酸盐的积累量非常少。分子分析显示，五种最丰富的微生物构成了反硝化菌群，它们之间存在有利于反硝化的代谢相互作用。在25°C时，Hydrogenophilaceae属微生物占主导地位，与Thiobacillus_1共同通过碳固定为整个菌群提供能量。我们的结果表明，主要菌群成员之间的底物交换提高了整个菌群在低温下的适应能力。然而，Burkholderiaceae属微生物（唯一提供吡哆醇和谷氨酰胺的菌株）在5°C时生长速度不足，导致主要反硝化菌之间的代谢相互作用失衡，最终引起亚硝酸盐积累。这表明，低丰度微生物可能在帮助微生物群落维持低温下的反硝化活性方面起着重要作用。最后，我们的研究表明，硫依赖型反硝化作用在低至10°C的温度下也能高效运行，表明其具有实际应用潜力。

引言

湖泊和河流等水体的氮污染是一个重大的环境问题，因为它会导致富营养化，对鱼类造成毒性，并促进温室气体（如一氧化二氮N₂O）的释放（Kuypers等人，2018年）。传统的污水处理厂依靠异养反硝化作用去除废水中的固定氮（Duan等人，2021年），但这一过程需要昂贵且大量的外部有机碳输入，并且常常会导致污水处理厂排放温室气体（Daelman等人，2012年，2013年）。这些限制促使人们开发了替代的自养氮去除途径。

将反硝化作用与硫化合物的氧化（例如S^2?、S₂O₃^2?、S₀）结合起来，被提出用于处理碳氮比较低的废水，因为这种过程对有机电子供体的需求较低（Guo等人，2022年；Qian等人，2021年；Tian和Yu，2020年；Zhang等人，2024年）。这种方法对中国市政污水处理厂的废水特别适用，因为这些工厂的总氮浓度通常在20毫克/升左右（Qu等人，2022年），硝酸盐是主要的氮形式，且可利用的有机化合物几乎耗尽。这表明这些污水处理厂受到电子供体的限制，因此硫依赖型反硝化作用适合在排放前去除剩余的氮（Li等人，2020年；Sahinkaya等人，2014年）。尽管硫依赖型反硝化作用产生的硫酸盐浓度升高可能带来二次污染风险，但与有机驱动的反硝化作用相比，其显著较低的经济成本使其成为未来应用的有前景的技术（Pang和Wang，2021年；Wang等人，2023年）。

然而，硫依赖型反硝化作用在大型污水处理厂中的应用仍受到低温下性能不佳的限制。在高纬度和高海拔地区，市政废水通常未经预热，冬季温度较低（通常为8–15°C，甚至可能低于5°C）（Zhou等人，2018年）。低温通常会导致微生物的活性和生长速率降低，据报道硫依赖型反硝化菌在15°C以下的反硝化活性较低（Di Capua等人，2016年；Guo等人，2022年；Oh等人，2000年；Qi等人，2023年）。尽管先前的实验室和试点规模研究表明，新的接种方法和添加外部电子供体可以改善低温下的反硝化性能，但这些干预措施往往会改变研究系统的微生物群落组成（Guo等人，2022年；Li等人，2020年；Qi等人，2023年；Zhang等人，2022年）。到目前为止，尚未可靠地建立能够在持续低温条件下保持高活性的稳定硫依赖型反硝化微生物群落。

重要的是，自然系统和人工系统中的微生物很少单独发挥作用。相反，微生物过程通常由复杂的群落介导，其中代谢相互作用（包括底物交换和交叉喂养）可以增强群落稳定性并减少单个种群的能量限制（Mee等人，2014年；Yu等人，2022年；Zengler和Zaramela，2018年）。对于硫依赖型反硝化系统，多项研究表明异养和自养反硝化菌可以共同进行反硝化（Han等人，2020年；Qiu等人，2020年；Zhang等人，2018年）。基于宏基因组分析的短期培养研究表明，主要硫依赖型反硝化菌之间可能存在氨基酸和辅因子的交换（Li等人，2023年）。然而，微生物相互作用本质上是动态的，并且对温度波动等环境压力因素敏感（Nguyen等人，2021年）。在这种条件下，即使低丰度的种群也可能在维持群落功能和促进恢复方面发挥重要作用（Micali等人，2023年）。对于硫依赖型反硝化作用，温度降至约15°C时会导致密切相关分类单元内的种群结构发生变化（Xing等人，2020年），但在长期暴露于低至5°C的温度下，驱动这些变化的机制尚不清楚。关键的是，大多数现有研究依赖于短期实验或单一温度观测，因此在硫依赖型反硝化群落如何适应持续低温压力以及微生物种群动态和代谢功能如何共同影响长期反应器性能方面存在很大的知识空白。

我们假设硫依赖型反硝化作用在低温下的韧性不仅取决于硫氧化反硝化菌的生理能力，还取决于群落组成和代谢相互作用的温度依赖性变化。为了验证这一假设，我们富集了适应低温的菌株，并将其应用于具有五个温度梯度的长期连续生物反应器中，同时利用综合组学分析来研究群落和代谢功能对低温的响应。我们的结果表明，微生物之间的交叉喂养促进了整个菌群的反硝化作用，即使在10°C时也能实现高效的反硝化；而在5°C时，为群落提供辅因子的微生物无法有效生长，这很可能导致了观察到的亚硝酸盐积累。综上所述，我们的发现强调了不同反硝化微生物之间的交叉喂养在增强微生物群落对不利环境条件适应性方面的重要性，并提出了通过增加这些底物提供者的丰度来提高低温下硫依赖型反硝化效率的潜在策略。

采样与富集

内蒙古高原是典型的高海拔、高纬度寒冷地区，年平均温度仅为3–6°C。乌梁素海湖（40°59′59.2″，108°50′58.9″）是黄河流域最大的淡水湖，受到市政污水和工业废水的污染，硝酸盐氮浓度约为2.38毫克/升（Dang等人，2022年；Yang等人，2019年）。该湖每年有五个月的结冰期，这表明……

富集过程中的硝酸盐还原

在前三次亚培养阶段中，SRT培养物的硝酸盐还原率和硫代硫酸盐氧化率分别比SLT培养物快29.5%和14.2%（图1a，b）。具体来说，SRT和SLT培养物的硝酸盐还原率分别为0.07（±0.02；n=12）毫摩尔/小时和0.05（±0.01；n=12）毫摩尔/小时。SRT和SLT培养物的硫代硫酸盐氧化率分别为0.13（±0.03；n=12）毫摩尔/小时和0.11（±0.03；n=12）毫摩尔/小时。

结论

本研究表明，在适应性的微生物群落支持下，硫依赖型反硝化作用能够在低温条件下持续高效去除硝酸盐。反应器性能稳定至10°C，而进一步降低温度至5°C时会导致亚硝酸盐积累和群落失衡。综合组学分析表明，微生物种群和代谢潜力的温度依赖性变化……

CRediT作者贡献声明

卓江：写作——审稿与编辑；撰写初稿；可视化；验证；软件开发；方法学研究；数据分析；概念构建。帕洛玛·加里多-阿马多尔：写作——审稿与编辑。博兰·卡尔塔尔：写作——审稿与编辑；监督。纪国东：写作——审稿与编辑；验证；监督；资源管理；项目协调；资金争取；概念构建。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（NSFC）（项目编号：U22A20557）和中国国家重点研发计划（项目编号：2021YFB2600104）的支持。我们还要感谢北京大学的高性能计算平台在组学分析方面的支持。