《Bioresource Technology Reports》：Protease production by
Penicillium roqueforti through solid-state fermentation of ora-pro-nóbis (
Pereskia aculeata): optimization and characterization
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可持续微生物酶生产策略研究：以Penicillium roqueforti固体发酵为例，通过混合原料（ora-pro-nóbis与大豆粕1:1）优化发酵条件（144h,25℃）获得4.29U/mL活性蛋白酶，其热稳定、钙激活特性及高MCA/PA比值（116.11）表明工业应用潜力，为农业废弃物资源化利用提供新路径。
埃米利亚·卡梅姆·达·席尔瓦（Emília Carmem da Silva）、马特乌斯·佩雷拉·弗洛雷斯·桑托斯（Mateus Pereira Flores Santos）、贾布森·梅内塞斯·特谢拉（Jabson Meneses Teixeira）、弗洛里亚坦·桑托斯·科斯塔（Floriatan Santos Costa）、拉斐尔·达·科斯塔·伊列乌·丰坦（Rafael da Costa Ilhéu Fontan）、克里斯蒂安娜·马丁斯·维洛索（Cristiane Martins Veloso）、马塞洛·弗朗科（Marcelo Franco）和雷娜塔·克里斯蒂娜·费雷拉·博诺莫（Renata Cristina Ferreira Bonomo）
巴西巴伊亚州西南部州立大学过程工程实验室，地址：45700-000，伊塔佩廷加（Itapetinga），巴伊亚州
摘要
由于食品工业对高效、低成本替代品的需求增加，对可持续微生物酶的需求也在不断增长。蛋白酶在奶酪制作和生物活性肽的生产中至关重要。本研究旨在通过固态发酵（SSF）利用替代底物来生产并表征来自Penicillium roqueforti ATCC 10110的蛋白酶，并优化发酵产率。研究结合使用了ora-pro-nóbis、mandacaru和豆粕，通过简单中心设计和Box–Behnken设计评估了底物比例、温度、水分和发酵时间对蛋白酶产量的影响。最佳条件为144小时、25°C和70%的水分，其中ora-pro-nóbis与豆粕以1:1的比例混合时产率最高（4.29 U/mL）。该提取物具有牛奶凝固活性（482 ± 1.52 U/mL）、较高的MCA/PA比值（116.11）、在pH 6.0和60°C时的最佳活性、热稳定性、Ca2+激活作用，以及23 kDa的分子量。这些结果突显了SSF作为蛋白酶生产的一种可持续策略。
引言
蛋白酶（也称为肽酶）是一类重要的酶，能够催化蛋白质中肽键的断裂，生成较小的肽和游离氨基酸。它们占全球酶市场的约60%，是工业生物技术领域中最具相关性的酶类之一，在自然界中分布广泛（Sisa等人，2023年）。随着对工业酶需求的增加，人们致力于发现、重新设计或合成具有改进特性的生物催化剂。这些酶代表了可持续、环保且具有商业可行性的替代品，可应用于多个领域（Solanki等人，2021年）。尽管蛋白酶可以从动物和植物来源中获取，但由于微生物在经济和技术上的优势以及基因操作的可能性，它们已成为主要的蛋白酶生产来源（Dos Santos Aguilar和Sato，2018年）。
在产生酶的微生物中，丝状真菌起着重要作用。Penicillium roqueforti是一个典型的例子，它具有生态多样性，能够适应多种环境生态位，其菌株表现出适应性分化的特征。该物种因在蓝纹奶酪生产中的关键技术作用而广受认可（Crequer等人，2024年）。在成熟过程中，P. roqueforti菌株表现出较高的酶活性，能产生独特的芳香化合物或其前体。在蛋白水解方面，这种真菌分泌多种蛋白酶，参与酪蛋白的水解，释放出生物活性肽和游离氨基酸，凸显了其在食品工业中的技术潜力（Gillot等人，2017年）。这一特性使P. roqueforti成为固态发酵（SSF）中生产酶的理想候选菌株。
SSF已被证明是一种高效且可持续的蛋白酶生产策略，尤其是当与农工业副产品作为底物结合使用时。这种方法有助于降低成本、实现有机废物的增值，并促进循环经济的发展，符合联合国的可持续发展目标（SDGs），特别是目标9、12和13（Colla等人，2023年）。此外，SSF中酶生产的效率取决于多个变量，包括底物选择、发酵条件以及所用微生物的特性（Sosa-Martínez等人，2023年）。为了优化这些过程，广泛应用了混合实验设计和响应面方法等统计技术，这些技术可以系统地评估工艺变量及其相互作用，并开发预测模型，从而在减少时间、能源和试剂消耗的同时最大化产量（Mu?oz-Seijas等人，2024年；Hadrich，2025年）。
在本研究中，底物的选择基于其营养价值和区域可用性。豆粕是提取大豆油的主要副产品，具有均衡的营养成分，含有46%的蛋白质、0.5%的残留脂质、7%的粗纤维和12%的水分（López-Trujillo等人，2023年）。作为替代底物，选择了原产于南美洲、富含蛋白质、矿物质（铁和钙）、β-胡萝卜素和维生素的ora-pro-nóbis（Pereskia aculeata Miller）以及典型分布于巴西半干旱地区的mandacaru（Cereus jamacaru DC），后者富含碳水化合物、氨基酸和膳食纤维（de Vasconcelos Medeiros等人，2024年）。使用这些底物旨在提高P. roqueforti在SSF中的酶产量，同时实现可持续和具有成本效益的解决方案。
在食品工业中，蛋白酶具有多种功能，包括软化肉类、凝固牛奶以及改善蛋白质的功能特性（如乳化性和溶解性（Arya等人，2022年）。特别是在乳制品行业，酸性蛋白酶作为牛奶凝固剂，催化酪蛋白中特定键（Phe105-Met106）的水解，生成κ-酪蛋白和大肽（Azadi等人，2022年）。
因此，本研究旨在利用替代的农工业底物通过SSF优化Penicillium roqueforti ATCC 10110的蛋白酶生产，并对其生化特性进行表征，包括稳定性、酶活性和凝固牛奶的能力。研究结果不仅有望扩展技术和科学知识，还为食品工业提供创新和可持续的解决方案，为更加可持续和环保的未来做出贡献。
材料
本研究使用了从Sigma Aldrich Brazil购买的牛酪蛋白、酪氨酸和Coomassie brilliant blue。其他试剂将在方法部分详细说明。用于发酵的豆粕、ora-pro-nóbis（Pereskia aculeata Miller）叶子和mandacaru（Cereus jamacaru DC）茎分别从当地零售商和巴西巴伊亚州伊塔佩廷加的农村地区采购。
底物表征
表1列出了用于SSF生产蛋白酶的农工业副产品的近似成分。
百分组成分析显示，所评估底物的营养成分存在显著差异，其中蛋白质含量是SSF中蛋白酶生产的关键参数。结果表明，豆粕的蛋白质含量最高（47.18% ± 0.53），其次是ora-pro-nóbis（17.92% ± 0.15）和mandacaru（5.78% ± 0.54）。
结论
本研究证明了使用替代植物基底物通过SSF生产Penicillium roqueforti ATCC 10110蛋白酶的可行性。简单中心设计和Box-Behnken设计的应用对于确定最佳发酵条件至关重要，体现了统计工具在提升酶生物技术效率方面的作用。ora-pro-nóbis与豆粕的组合被证明是最有利的配方，实现了氮元素的平衡
CRediT作者贡献声明
埃米利亚·卡梅姆·达·席尔瓦（Emília Carmem da Silva）：撰写——初稿、验证、研究、数据分析、概念构建。马特乌斯·佩雷拉·弗洛雷斯·桑托斯（Mateus Pereira Flores Santos）：撰写——审阅与编辑、可视化。贾布森·梅内塞斯·特谢拉（Jabson Meneses Teixeira）：方法学研究。弗洛里亚坦·桑托斯·科斯塔（Floriatan Santos Costa）：方法学研究。拉斐尔·达·科斯塔·伊列乌·丰坦（Rafael da Costa Ilhéu Fontan）：撰写——审阅与编辑、可视化。克里斯蒂安娜·马丁斯·维洛索（Cristiane Martins Veloso）：撰写——审阅与编辑、可视化。马塞洛·弗朗科（Marcelo Franco）：撰写——审阅与编辑、资源协调。雷娜塔·克里斯蒂娜·费雷拉·博诺莫（Renata Cristina Ferreira Bonomo）：撰写
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
作者感谢巴西高等教育部人员培训协调机构（CAPES）、国家科学技术发展委员会（CNPq）以及巴伊亚州西南部州立大学（UESB）为这项工作提供的财政支持。
