基于DNA分子减法技术的杂交链反应（Hybridization Chain Reaction，PCR），用于高对比度检测和选择性杀伤癌细胞

《Biosensors and Bioelectronics》：DNA molecular subtraction controlled hybridization chain reaction for high contrast detecting and selective killing of cancer cells

本策略通过DNA分子减法调控杂交链反应（SHCR），利用miR-182和miR-30a在癌细胞与正常细胞中的表达差异实现高对比成像和选择性免疫原性细胞死亡，增强癌症特异性治疗。

　　

杨丰瑞|江晓 rou|雷玲玲|陈增平|余茹琴

中国湖南省长沙市湖南大学化学与化学工程学院化学与生物传感国家重点实验室，邮编410082

摘要

miRNA引发的杂交链反应（HCR）已被用于细胞内成像和癌症免疫调节研究。然而，其特异性常常受到限制，因为某些与癌症相关的miRNA在正常细胞中也以低水平表达，导致对比度不足和脱靶细胞毒性。本文报道了一种基于DNA分子减法控制的杂交链反应（SHCR）策略，用于实现高对比度检测和选择性激活癌细胞的免疫细胞毒性。在该策略中，一个部分互补的双链结构（S1/S2）在信号放大之前对两种同源miRNA（miR-182和miR-30a）进行化学计量级的分子减法。剩余的miR-182随后触发荧光标记的发夹结构之间的HCR反应，产生FRET信号和双链DNA。由于MCF-7细胞中miR-182（上调）和miR-30a（下调）的表达模式不同，SHCR显著提高了成像对比度，使细胞内的荧光比值差异从1.5倍增加到3.5倍。产生的双链DNA进一步激活cGAS–STING通路，诱导癌细胞的免疫细胞毒性，同时将对正常细胞的损伤降至最低。通过将DNA分子减法与无酶扩增技术相结合，SHCR建立了一个响应差异表达的框架，用于高对比度区分癌细胞和选择性功能激活，为基于核酸的精准治疗提供了多功能策略。

引言

microRNA（miRNA）是一类长度约为20至25个核苷酸的内源性小非编码RNA，在真核生物中具有特定的调控功能（Fukunaga等人，2012年；Jouravleva和Zamore，2025年）。研究表明，miRNA的异常表达通常与多种人类癌症的进展和发展有关（He等人，2005年；He等人，2016年；McCoy等人，2018年）。例如，miRNA-30的下调与乳腺癌的发展相关（Croset等人，2018年；Mahlab-Aviv等人，2020年）。miRNA-21和miRNA-182的上调增加了癌症发生和转移的风险（Lei等人，2014年；Meyer等人，2022年；Zhao等人，2019年）。因此，在临床研究中，miRNA不仅被用作疾病诊断的潜在生物标志物（Shin等人，2022年），还被用作恶性肿瘤治疗的治疗靶点（Lee等人，2024年；Schreiber等人，2024年）。

通过经典方法如Northern印迹（Lai等人，2023年）、微阵列（Jet等人，2025年）和实时定量PCR（Yuan等人，2017年）可以实现对体液中miRNA的高灵敏度检测。然而，miRNA的细胞内成像研究仍处于发展阶段（Wei等人，2023年）。包括DNA纳米机器（Liang等人，2017年；Song等人，2022年）、杂交链反应（Wu等人，2015年；Yu等人，2025年）、DNA逻辑电路（He等人，2023年；Xiao等人，2024年；Xie等人，2025年）、催化发夹组装（CHA）（Liu等人，2019年）、熵驱动催化反应（EDC）（Xing等人，2020年）、滚环扩增（RCA）（Yue等人，2021年）、CRISPR-Cas系统（Hu等人，2025年；Liu等人，2025年）以及酶激活信号放大策略（Liu等人，2022年；Shang等人，2022年）在内的各种先进技术已被初步应用于细胞内miRNA的检测，从而实现癌细胞的区分。尽管这些方法通常具有高灵敏度的优点，但它们仅利用目标miRNA的浓度信息来区分癌细胞和正常细胞。由于某些与癌症相关的miRNA在正常细胞中也以相对较低的水平表达，这些方法的性能可能会受到影响。

最近在miRNA检测方面的进展表明，使用DNA纳米技术和无酶扩增策略（包括杂交链反应HCR及相关等温扩增系统）可以实现高灵敏度和多重分析（Liu等人，2022年；Wu等人，2021年；Yang等人，2023年）。特别是HCR因其可编程性和无酶操作而成为一种强大的信号放大平台，并已被广泛用于生物传感和细胞内成像应用（Zhao等人，2021年；Yang等人，2025年）。

除了检测之外，在miRNA驱动的癌症治疗方面也取得了显著进展（Zhou等人，2021年）。例如，Morihiro等人报道了一种溶瘤RNA发夹对（oHP）（Morihiro等人，2024年）。癌细胞中高表达的miR-21可以与oHP结合并触发杂交链反应，生成长双链DNA，激活p53-p21信号通路，导致细胞周期在S期停滞并诱导癌细胞凋亡。现有的miRNA驱动的癌症疗法通常由目标miRNA激活，而这些miRNA在正常细胞中也可能以较低水平表达，因此它们不仅对癌细胞具有细胞毒性，也对正常细胞具有毒性。因此，能够选择性杀死癌细胞的miRNA驱动的癌症疗法非常受欢迎。

为了克服传统miRNA驱动的检测和治疗策略的局限性，我们开发了一种基于DNA分子减法的SHCR系统。该策略利用了肿瘤细胞（MCF-7）中miR-182上调而miR-30a下调的差异表达模式，从而实现不同的DNA分子减法结果（图1）。在MCF-7细胞中，减法后剩余的miR-182触发HCR反应，产生强烈的FRET信号和双链DNA。相比之下，MCF-10A细胞中仅残留少量miR-182，导致信号显著减弱，从而提高了成像对比度。产生的双链DNA进一步激活cGAS–STING通路，诱导癌细胞的免疫细胞死亡，同时对正常细胞的毒性较低。本文提出的SHCR策略引入了一种基于减法的机制，在信号放大之前对两种同源miRNA进行化学计量级的分子减法。与产生布尔输出或独立的多重信号（Seelig等人，2006年）不同，SHCR定量反映了两种miRNA之间的相对丰度差异。这一概念性的区别将SHCR定位为核酸计算框架内的差异表达响应放大系统。与传统的比率或双发射传感策略相比（后者产生两个独立信号后进行信号归一化（Liu等人，2017年），SHCR在扩增之前在反应层面进行分子减法。这种内在的计算过程能够直接将差异miRNA表达转化为放大的输出信号，从而减少来自正常细胞低水平表达的背景干扰。此外，与需要同时激活多个发夹以产生逻辑输出的级联多输入HCR系统（Wu等人，2016年）不同，SHCR将减法和扩增整合到一个统一的反应框架中。因此，通过采用表达不平衡作为核心响应机制，而不是依赖于单一触发因子的绝对存在，该系统从根本上超越了传统HCR的单输入激活模式，建立了一种由相对表达差异驱动的新分子计算范式，为差异表达导向的精准治疗提供了创新的设计原理和技术框架。

部分内容

溶液中DNA分子减法的验证

使用NUPACK（https://nupack.org/）设计了一种由S1和S2链组成的部分互补双链DNA结构（S1/S2），以实现miR-182和miR-30a之间的DNA分子减法（图1a）。进一步评估了S1/S2模块的结合长度（图S1，支持信息），8个核苷酸的设计在我们的实验条件下显示出高效的链置换和良好的特异性。miR-182和miR-30a可以与之杂交

结论

本文提出了一种基于DNA分子减法控制的杂交链反应（SHCR）策略，用于实现高对比度检测和选择性杀死癌细胞。在该系统中，一个部分互补的双链结构（S1/S2）能够对miR-182和miR-30a进行分子减法。剩余的miR-182随后触发H1-TAMRA/Cy5和H2-FAM之间的HCR反应，产生FRET信号。

由于在MCF-7细胞中miR-182上调而miR-30a下调

CRediT作者贡献声明

杨丰瑞：撰写——原始草稿、方法学、正式分析。雷玲玲：可视化、研究。江晓 rou：研究、数据管理。余茹琴：撰写——审阅与编辑。陈增平：撰写——审阅与编辑、监督、项目管理、资金获取、概念化

未引用的参考文献

Shin等人，2020年；Song等人，2022年；Yang等人，2025年。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（22273020和22573029）和湖南省研究生创新基金（LXBZZ2024040）的支持。杨丰瑞感谢中国留学基金委（202506130068）的支持。