具有空间有序级联酶的层次结构MOFs用于灵敏的亚硝酸盐免疫传感

《Biosensors and Bioelectronics》：Hierarchical MOFs with Spatially Ordered Cascade Enzymes for Sensitive Nitrite Immunosensing

构建基于分层金属有机框架的多酶级联催化系统，通过PVP/组氨酸化学修饰实现葡萄糖氧化酶（GOx）高效固定（74.43%），结合镍触发的MOF孔道调控（孔隙扩大至5.68 nm），显著提升HRP催化活性，在硝酸盐免疫检测中灵敏度达0.05 μg mL?1，较传统ELISA提高1000倍。

　　

李Houru|王Herui|李Mengxue|徐 Yan|李Hongxia

吉林大学食品科学与工程学院食品质量与安全系，长春130062，中国

摘要

提高固定化酶的生物活性和利用效率对于构建灵敏的免疫传感器至关重要。然而，传统方法往往受到酶随机空间分布的限制，这会降低级联效率。在这里，我们通过空间有序的层次组装构建了一个多层金属-有机框架（MOF）。这种设计使得葡萄糖氧化酶（GOx）和辣根过氧化物酶（HRP）能够有序地分隔开，从而促进了中间产物的转移，并显著提高了级联催化活性。进一步的改进包括微环境修饰和表面蚀刻。具体来说，使用聚维酮（PVP）和组氨酸（His）进行微环境调控，实现了74.43%的高GOx封装效率。此外，Ni触发的蚀刻将MOF的孔径从2.21纳米扩大到5.68纳米，降低了底物的传质阻力，并使级联酶的催化活性提高了两倍。作为概念验证，当这种复合材料用作免疫传感器中的信号放大器时，其对亚硝酸盐的检测灵敏度极高，检测限为0.05 μg/mL^-1，比传统的酶联免疫吸附测定法提高了1000倍。本研究为高效固定化和增强级联酶的活性提供了有价值的策略，为在构建高灵敏度免疫传感器中应用可控纳米结构提供了指导。

引言

酶联免疫吸附测定法（ELISA）是一种有前景的技术，它利用抗原和抗体之间的特异性结合，通过酶标记协议将免疫反应信号转化为可测量的光学信号，广泛应用于环境检测和临床诊断（Brigger等人2021；Klumpp-Thomas等人2021；Kongsuwan等人2019；Wang等人2022；Yang等人2021）。与比色法（Su等人2025）、太赫兹光谱（Hamza等人2024a；Hamza等人2025c）和表面增强拉曼散射（Huang等人2022）等新兴技术相比，ELISA具有更高的特异性。尽管这些替代方法在操作简便性或多重检测能力方面具有优势（Hamza等人2024b；Hamza等人2025d），但它们通常缺乏ELISA所固有的严格目标识别能力。然而，由于酶本身的脆弱性和不稳定性，使用酶作为信号放大器存在显著限制，这限制了它们在实际应用中的使用（Cao等人2012；Han等人2018；Sha等人2023；Shi等人2014；Tahsiri等人2022；Zhang等人2018）。此外，标记酶的催化效率往往不足以检测痕量目标，这是在开发高灵敏度免疫传感器时持续面临的挑战（Chiang等人2020；Ge等人2025；Park等人2023；Sadeghi等人2024；Song等人2023）。因此，需要不断探索高效的酶固定化方法来提高ELISA的性能。因此，整合坚固的功能材料以稳定酶并增强其催化效率是一种可行的策略，以弥补这一差距（Hamza等人2025a；Hamza等人2025b）。

尽管通过交联酶聚集体（Bornscheuer等人2012）和DNA导向组装（Pei等人2016；Zhou等人2022）方法在酶级联固定化方面取得了进展，但仍存在关键挑战，包括酶-底物相互作用不佳以及在恶劣条件下的操作稳定性有限（Wei等人2020）。这些缺点通常会降低催化效率和重复使用性，尤其是在多酶系统中。因此，最近的研究重点在于设计能够空间组织酶同时保持其天然活性的多孔材料（Kong等人2023）。金属-有机框架（MOFs）因其可调的孔结构、高表面积和优异的生物相容性而成为嵌入酶的理想支架。先进的研究表明，通过肽功能化表面工程或精确控制的MOF矩阵蚀刻可以维持固定化系统中的酶活性（Kim等人2015；Man等人2022；Riccò等人2018；Weng等人2024；Zheng等人2023）。将多种酶封装在单个MOF中是通过限制底物逃逸来提高酶级联活性的关键方法。最近特别关注其在生物催化系统中的应用（Chen和Wu 2019；Jiao等人2017；Li等人2023；Liang等人2015；Lin等人2024；Xu等人2019；Yilmaz等人2019），多酶固定化主要遵循两种策略：i) 在单个MOF中共沉淀或生物矿化酶导致酶的随机定位（Chen等人2018）；ii) 将单个酶分别封装在不同的MOF中，然后进行复合组装（Ngo等人2016）。虽然共封装简化了操作，但酶的随机分布会创建无序的微环境，阻碍底物扩散并施加酶-酶之间的空间限制，最终降低催化活性和级联效率（Yin等人2022）。此外，过度的壳层生长会阻碍底物扩散，从而降低整体催化效率（Cui等人2016；Dissegna等人2018；Ma等人2019；Yu等人）。因此，开发能够在保持高组装效率和催化活性的同时实现酶空间控制的先进MOF封装策略是该领域的一个关键科学挑战。

在这里，我们报告了一种层次组装策略，用于将级联酶作为强大的信号放大器来构建高灵敏度的免疫传感器。该放大器是一种空间有序的多酶MOF复合材料，通过层次化和顺序嵌入葡萄糖氧化酶（GOx）和辣根过氧化物酶（HRP）来提高级联效率和稳定性（图1a）。在合成过程中，GOx通过聚维酮（PVP）和组氨酸（His）的化学修饰被封装到MOF的空腔中。PVP和His的功能基团与酶形成氢键或静电相互作用，从而提高固定化效率并调节酶的微环境。这一过程防止了酶的变性，并保持了稳定的催化构象。随后，在异质界面通过控制生长在外表面涂覆第二层MOF，封装HRP以构建层次有序的级联酶系统。通过蚀刻MOF来调节孔径，合成了葡萄糖氧化酶@聚维酮-组氨酸功能化金属-有机框架@辣根过氧化物酶@镍-MOFs（GOx@PH-MOFs@HRP@Ni-MOFs）。作为概念验证，我们构建了一种用于亚硝酸盐检测的材料联免疫吸附测定法（MLISA）。为此，将GOx@PH-MOFs@HRP@Ni-MOFs纳米复合材料与抗体结合，作为信号放大器。该测定采用竞争格式，其中游离的亚硝酸盐衍生物和包覆的抗原竞争与有限量的初级抗体的结合。与传统ELISA相比，这种方法提高了三个数量级的检测灵敏度（图1b）。这种灵敏度的提高主要归因于复合材料的层次结构显著降低了传质阻力并改善了底物的可及性，以及酶和抗体的大量装载。本研究实现了酶级联的高效固定化和活性增强，提高了它们在生物传感器和制造业中的实际应用。

部分摘录

GOx@PH-MOFs@HRP@Ni-MOFs的合成

将100 μL的GOx水溶液（50 mg/mL^-1）、200 μL的PVP（3 mg/mL^-1）和100 μL的His（3 mg/mL^-1加入离心管中，混合1分钟后，加入400 μL的2-mIM（160 mM）和400 μL的Zn(NO₃)₂（40 mM）。在25°C下摇晃1小时，然后以8000 rpm离心5分钟，去除上清液并用去离子水洗涤两次。根据上述步骤合成的GOx@PH-MOFs重新溶解在100 μL水中。在500 rpm下，加入400 μL的2-mIM（160

GOx@PH-MOFs@HRP@Ni-MOFs的合成与表征

层次结构GOx@PH-MOFs@HRP@Ni-MOFs复合材料的合成过程如图1a所示。利用2-甲基咪唑（2-mIM）和Zn²⁺之间的强配位作用，在内层MOF的合成过程中将GOx封装在PVP/His修饰的MOF中（表示为GOx@PH-MOFs），其中PVP和His调节配位微环境。然后封装HRP形成外层MOF（表示为GOx@PH-MOFs@HRP@MOFs）。

结论

总之，本研究介绍了一种可转移的策略，它结合了空间有序的层次组装和合成后的孔工程，显著提高了生物传感器的灵敏度。我们开发了一种多层GOx@PH-MOFs@HRP@Ni-MOFs结构，通过PVP和His的有效配位微环境调节，实现了高达74.43%的GOx封装效率。该设计的创新之处如下：首先，空间有序的

CRediT作者贡献声明

王Herui：撰写——原始草稿、研究、正式分析、数据管理、概念化。李Houru：撰写——原始草稿、数据管理。徐 Yan：撰写——审阅与编辑、监督、方法学。李Mengxue：软件、正式分析。李Hongxia：撰写——审阅与编辑、资源管理、项目行政、资金获取

未引用参考文献

Yu等人。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

数据可用性

支持本研究发现的数据可向相应作者索取。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢国家自然科学基金（62371204）、吉林省自然科学基金（20250203073SF）和中央高校基本科研业务费的财政支持。