综述：计算双循环框架：将单酶设计与级联隧道网络工程相结合，用于下一代生物合成系统

《Biotechnology Advances》：Computational dual-loop frameworks bridging single-enzyme design and cascade tunnel network engineering for next-generation biosynthetic systems

酶工程优化与计算生物学融合的双循环DBTL框架研究，整合分子模拟与多酶系统协同设计，解决代谢通路中的中间体泄漏和传质瓶颈。摘要：

　　

李阳阳|杜国成|陈健|吕学勤|刘龙

教育部碳水化合物化学与生物技术重点实验室，江南大学，中国无锡214122

摘要

计算生物学的进步正在将酶工程从经验性实践转变为一种基于预测和模型的学科。传统的策略，如定向进化和理性设计，虽然提高了催化性能，但往往无法解决涉及稳定性、辅因子不兼容性和中间产物泄漏的系统级瓶颈问题。本文综述了计算酶工程的最新进展，重点关注结构预测、突变效应建模、多尺度分子模拟和多酶网络工程。我们将所研究的内容置于一个双循环的设计-构建-测试-学习（DBTL）框架中，以连接分子层面的酶设计与途径层面的整合。第一循环总结了单酶优化的计算策略，包括基于深度学习的结构和适应性预测、分子动力学（MD）模拟以及量子力学/分子力学（QM/MM）分析，这些方法阐明了结构-功能关系并指导了迭代改进。第二循环将这些方法扩展到多酶系统，回顾了关于底物通道工程、静电耦合和时间协调的最新研究，这些研究有助于实现酶级联中的高效中间产物转移和平衡通量。与主要关注个别计算方法或单酶优化的现有综述不同，本文强调了在统一的DBTL框架内将酶的机械模型与多酶网络设计相结合的重要性。通过整合这些领域的进展，我们提供了关于计算引导的酶工程当前能力、局限性和未来方向的系统概述。

引言

酶在代谢工程和合成生物学中占据中心地位，它们作为分子机器，精确地将底物转化为高价值化合物（Orsi等人，2024年）。在过去十年中，酶工程领域经历了范式转变，从优化单个催化反应转向系统性地重新设计整个代谢途径（Liang等人，2024年）。这种转变源于人们越来越认识到，在单酶层面的改进并不一定能带来途径性能的相应提升。相反，整体生物合成效率取决于途径内多个催化节点之间的时空协调和能量耦合（Frazao等人，2023年；Tang等人，2024年）。即使单个酶的催化转化率和底物特异性得到了提高，这样的单酶改进也往往只能部分缓解系统级瓶颈问题，包括中间产物泄漏、动力学不平衡和辅因子不兼容性（Ding等人，2024年；Landwehr等人，2025年）。这些见解凸显了需要集成设计策略的需求，以将单酶优化与途径层面协调结合起来，从而构建高效、动态平衡的生物合成系统（Jasinska等人，2024年；Ledesma-Fernandez等人，2023年）。随着途径层面优化的复杂性增加，计算指导在理性酶设计中的作用变得越来越重要，而不仅仅是基于经验的试错方法。

酶工程中的计算概念可以追溯到定向进化的时代，早期的研究表明，通过迭代突变和选择可以导航序列-功能关系（Arnold，1998年）。这一范式将定量分析引入了蛋白质工程，并随后激发了半理性和结构引导的设计策略，其中结构建模、分子对接和基于能量的评分使得功能性突变的靶向探索成为可能（Arnold，2018年；Bloom和Arnold，2009年）。计算生物学的最新突破开始重新定义酶工程的理论基础（Li等人，2025c）。基于深度学习的蛋白质结构预测器，例如AlphaFold3和RoseTTAFold All-Atom，能够为酶和复合物提供原子级分辨率的结构假设，当与分子模拟和机械建模结合时，有助于进一步分析别构调节、构象灵活性和催化机制（Callaway，2024年）。同时，蛋白质的基础模型（例如大规模蛋白质语言模型PLMs）将预测能力从单突变效应扩展到高维序列-功能关系，使得数据驱动的突变适应性和表观遗传相互作用探索成为可能（Hie等人，2024年；Schmirler等人，2024年；Zhou等人，2024c）。多目标优化算法和强化学习（RL）框架的并行进展现在允许在定义的设计空间内同时提高催化活性、稳定性和底物选择性（Markus等人，2023年）。总的来说，这些计算进展正在被整合到闭环的设计-构建-测试-学习（DBTL）架构中，在这种架构中，体外预测指导基因设计，实验反馈不断精炼模型精度（Lu等人，2024年；van Lent等人，2023年）。在微生物细胞工厂中，这种数字-生物共生建立了计算与实验之间的动态互动，加速了从经验性酶优化向基于数据的生物设计的转变。

基于这些发展，计算酶工程在单酶设计、通道工程和途径层面优化等方面取得了进展（Planas-Iglesias等人，2021年；Scherer等人，2021年）。然而，一个系统性地统一分子尺度酶优化与途径尺度控制原则的连贯理论框架仍然缺乏。在这篇综述中，最近的研究成果被组织在一个双循环DBTL框架内，以探讨酶级突变设计与途径级协调和通量控制之间的耦合（图1）。第一循环侧重于单酶调控，将序列和结构引导的设计与多尺度模拟（包括分子动力学（MD）和量子力学/分子力学（QM/MM）分析相结合，以阐明催化机制并指导理性修改（Lu等人，2024年）。第二循环将优化扩展到多酶组装和动态途径网络，其中通过工程化的通道、支架和静电走廊实现的空间组织支持了高效的中间产物转移和通量连续性（Guo等人，2024年）。这种双循环视角的定义特征在于这两个层面之间的双向耦合（图1）。优化的单酶被视为途径构建的模块化构建块，而系统层面的分析（如通量不平衡、中间产物泄漏和传输限制）被反馈用于指导后续的酶重新设计（Chong等人，2023年；Li等人，2025a）。通过这种结构化的反馈，双循环框架提供了一个统一的视角，将分子酶学与系统层面的代谢联系起来，从而更清晰地了解了如何合理设计高通量的生物合成网络。

本文首先总结了酶结构预测、催化优化和机制阐明的最先进计算策略，然后介绍了能够实现酶通道、催化口袋和界面动力学的定量时空控制的新兴方法。总体而言，这些策略已被整合到闭环DBTL循环中，建立了一个连贯的计算生态系统，加速了模块化、稳健和可持续的微生物生产系统的理性进化。在这个统一的框架中，酶工程被重新定义为一种基于预测的系统层面学科，从试错实践转变为支持下一代智能生物制造的数据驱动设计范式。

部分摘录

通过结构预测启动第一个闭环DBTL循环

鉴于酶的巨大组合突变空间和有益变异的稀缺性，彻底的实验探索是不切实际的，因此需要合理的策略来优先考虑有前景的突变。在闭环DBTL框架中，理性的酶工程本质上基于目标蛋白质的可靠结构表示，因为结构模型定义了指导后续构建、测试和学习阶段的设计假设（Sun等人，2022年）。

单酶DBTL循环的学习和优化阶段

结构模型和体外测试通常会产生大量的候选酶变体，要有效利用这些变体需要系统的学习而不是孤立的评估。因此，DBTL循环的学习阶段侧重于提取定量序列-结构-功能关系，以指导后续的理性优化轮次。

机制反馈和模型精炼完成第一个DBTL循环

虽然基于学习的模型可以识别有前景的变体，但它们的预测最终依赖于机制理解。机制反馈通过阐明突变变化如何重塑酶动力学和催化途径，从而完善了物理洞察和预测性能（Lv等人，2024年）。分子模拟的最新进展深刻影响了酶-底物相互作用的研究，提供了原子级的视角。

在第二个闭环DBTL循环中设计多酶网络

完成单酶DBTL循环后，范式从分子层面优化扩展到系统层面协调，从而启动了以多酶组织、中间产物转移和途径层面通量调节为中心的第二个闭环循环。在这个扩展的框架内，对单个酶功能的靶向精炼为构建协调的多酶系统奠定了基础，在这些系统中，高效和定向的中间产物转移是必不可少的。

结论和未来展望

本文提出的双循环框架将精确的分子层面酶调控与系统层面的级联协调结合起来，从而建立了一个统一的范式， bridges了原子级催化机制和代谢通量控制。第一循环通过深度学习模型、多尺度模拟和量子化学分析的协调应用，实现了突变效应、结构稳定性和催化动力学的多目标优化。

未引用的参考文献

Yang等人，2019年

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了中国国家重点研发计划（2024YFF1106502）、江苏省自然科学基金（BK20240202、BK20241619）、江苏省优秀博士后人才资助计划（2024ZB291）、CPSF博士后奖学金计划（GZC20240610）、博士后科学基金一般资助（2025M772525）以及江苏省合成生物学基础研究中心（BK20233003）的财政支持。