来自Whitmania pigra的抗凝肽LR可改善脑缺血-再灌注损伤

《Brain Research》：Anticoagulant peptide LR from Whitmania pigra ameliorates cerebral ischemia–reperfusion injury

缺血性脑卒中治疗中，水蛭肽（LR）通过抑制凝血酶、促进纤溶及改善脑灌注发挥神经保护作用，低剂量组（40 mg/kg）疗效与高剂量相当且安全性更优，为开发新型抗血栓药物提供依据。

　　

刘冉|江新燕|王子婷|黄向宇|马雅舒|白尔娜·努尔迈迈提|张晓|董瑞娟|张玉婷|袁瑞娟|彭伟

北京中医药大学中医学院，中国北京102488

摘要

背景

缺血性中风（IS）是全球导致死亡和残疾的主要原因之一。高凝状态和血栓形成在其发病机制中起着关键作用。水蛭提取的肽类物质，尤其是从Whitmania pigra中获得的肽类，显示出潜在的抗血栓和神经保护作用。本研究旨在探讨水蛭肽在脑缺血/再灌注损伤大鼠模型中的治疗效果及其作用机制。

方法

成年雄性Sprague-Dawley大鼠接受大脑中动脉阻塞后进行再灌注处理，以建立IS模型。大鼠分别接受低剂量或高剂量的水蛭肽、依达拉酮（作为阳性对照）或生理盐水。通过行为评估、梗死体积测量、激光散斑成像检测脑灌注情况，并进行组织病理学分析。同时分析血液流变学和凝血参数。此外，还使用ELISA方法检测凝血酶水平和纤溶因子。通过溶血情况和对主要器官的组织学评估来评估生物安全性。

结果

水蛭肽显著减少了梗死体积，改善了神经功能评分，增强了脑灌注，并保护了脑组织结构。它有效抑制了凝血酶的表达，改善了凝血功能，减少了红细胞聚集，并促进了纤溶活性。体外实验表明，该肽具有针对凝血酶的抗凝作用和纤溶特性。低剂量治疗的效果与高剂量相当或更优，且安全性更高。未观察到明显的毒性或溶血现象。

结论

来自Whitmania pigra的水蛭肽通过抗凝和纤溶作用，在脑缺血/再灌注损伤中发挥神经保护作用。这些发现支持其作为IS治疗新候选物的潜力。

试验注册

不适用。本研究未涉及人类参与者。

引言

中风是全球第二大死亡原因，也是中国的主要死亡原因之一，其中缺血性中风（IS）是最常见的类型（Wang等人，2020年）。IS的诊断和治疗高度依赖于时间，但血管再通率仍然较低，超过92%的非溶栓患者缺乏有效的药物选择（Tsivgoulis等人，2020年）。因此，迫切需要开发适用于更广泛非溶栓人群的疗法。高凝状态和血栓形成是IS的核心病理特征（Maino等人，2015年），抗凝治疗对于防止病情进展和改善脑循环至关重要（Powers等人，2019年）。尽管UFH和LMWH能有效抑制血栓形成，但长期使用可能导致出血和骨质疏松，限制了其在慢性疾病中的临床应用（Signorelli等人，2019年；Hawkins和Evans，2005年）。尽管现代再灌注疗法能够实现较高的血管再通率，但仍有相当比例的缺血性中风患者在成功再通后无法恢复有效的微血管灌注，这种现象通常被称为无灌注或无效再灌注，与不良临床结果相关（Sun等人，2024年；Hu等人，2023年）。从病理生理学角度来看，这种无效的再灌注与持续的微血管阻塞、内皮功能障碍以及下游微循环紊乱有关，而这些问题仅通过恢复大血管通畅性无法解决（Liu等人，2026年）。这些限制促使人们越来越关注更安全、更温和且天然来源的抗凝和抗血栓药物。

中医在预防和治疗中风方面有着悠久的历史和验证过的疗效。例如，中药方剂通心络已被证明能改善急性缺血性中风患者的功能恢复，并在大鼠模型中显示出神经保护作用（Fan等人，2024年；Dong等人，2024年；Cheng等人，2014年）。根据中医理论，IS的根本发病机制是“脑侧支阻塞”，而出血性中风则主要与“脑侧支血液溢出”有关。在整个中风过程中，“血瘀”被认为是核心病理机制，并被视为许多疾病的基本原因（Wang，2017年）。中医认为，心气失调会导致血流异常，表现为出血、淤血、血栓形成和微血栓等全身性血液疾病（Zhang等人，2023年）。因此，促进血液循环和消除血瘀的治疗原则适用于中风管理的所有阶段（Wang等人，2020年）。

中医中的动物源性药材因其强大的药理作用和能够直接作用于病变部位而受到重视，并广泛应用于心血管和脑血管疾病的治疗（Liu等人，2016年）。水蛭（Shuizhi）传统上用于“破血瘀、通侧支”，是PBCRBS方剂的关键成分，在治疗此类疾病方面显示出显著优势（Wang等人，2018年；Liu等人，2018年；Yu等人，2021年）。现代研究表明，水蛭提取物具有抗凝、抗血栓、抗炎和纤溶活性，使其成为动物源性药物中的代表性抗凝剂（Li等人，2022年）。在中国，许多心血管药物都是从水蛭中提取的。历史上，水蛭在1825年至1850年间在欧洲被广泛使用（Petrauskien?等人，2009年），自1963年被列入《中国药典》以来，其临床重要性一直未减（中国药典委员会，1963年）。常用的水蛭种类包括Whitmania pigra、Hirudo nipponica、Whitmania acranulata和Poecilobdella manillensis等约680种（Lynggaard等人，2022年；Sket和Trontelj，2008年）。

水蛭提取的药物成分复杂，包含多种活性成分，其中肽类是主要的生物活性物质。从吸血水蛭唾液中首次纯化的hirudin是最强的天然凝血酶抑制剂之一（Nowak和Bucha，1994年）。水蛭的血液激活作用与其生物学特性密切相关；在进食过程中，水蛭会分泌抗凝物质，进化过程使它们具备了丰富的抗凝因子系统（Baskova和Zavalova，2001年；Babenko等人，2020年）。现代研究表明，肽类可以抑制凝血因子，延长凝血时间，减少血小板聚集，并改善脑循环（Zhang等人，2022年）。在中医中，Whitmania pigra是最常用的水蛭种类，虽然它不吸血且不含hirudin（Tong等人，2022年），但仍表现出显著的抗凝和血液流变调节作用（Kui等人，2024年）。有证据表明，它可能含有具有独特结构和机制的新抗凝肽（Zheng等人，2015年；Yuan等人，2023年）。因此，系统地鉴定这些肽类并阐明其作用机制将有助于阐明其血液激活作用的物质基础，并支持基于中医的创新抗中风药物的开发。

近年来，肽类因其高特异性、良好的安全性和结构多样性而被越来越多地认为是药物发现的宝贵资源。新兴研究将肽类视为下一代治疗的“宝库”，特别是在心血管和神经系统疾病领域（Ru等人，2025年；Wang等人，2025年；Wu等人，2024年）。此外，一些生物活性肽在脑损伤和缺血性中风模型中显示出良好的神经保护效果，能够减轻炎症、调节凝血级联反应并改善微循环功能（Li等人，2023年；Yin等人，2022年）。这些进展共同强调了基于肽类的治疗的转化潜力，进一步支持了探索从Whitmania pigra中提取的抗凝肽作为中风干预新候选物的合理性。

在我们之前的研究中，我们研究了不产生hirudin的非吸血水蛭Whitmania pigra，并通过仿生酶解方法构建了一个肽库。通过分子对接和分子动力学模拟，我们确定了LR（LRELEDALEQER）作为潜在的凝血酶结合肽。结果表明，LR显著延长了PT和TT时间，直接抑制了凝血酶的酶活性，并主要与Exosite II区域相互作用，与Arg101和Arg233等关键残基形成稳定结合。这些发现表明，LR通过非共价构象调节而非直接催化位点阻断来抑制凝血酶活性。在健康大鼠和急性血瘀模型中的体内实验进一步证实了其在非缺血条件下的抗凝和降低粘度作用。剂量-反应分析显示，5 mg/mL的剂量即可改善血液流变学参数，更高剂量并未增强其效果；因此，本研究中选择40 mg/kg和20 mg/kg作为给药剂量（Hua等人，2025年）。

在此基础上，本研究使用MCAO/R大鼠模型系统评估了LR在缺血性中风中的治疗效果，旨在评估其作为基于肽类的中风治疗候选物的潜力，并阐明其作用机制。

材料与设备

来自Whitmania pigra的抗凝肽LR由GL Biochem Ltd.（中国上海）合成。凝血检测使用的是CS-2500全自动凝血分析仪（Siemens Healthcare Diagnostics，德国）。超滤管购自Millipore（美国马萨诸塞州Billerica）。依达拉酮注射液由中国国家医药集团国瑞药业有限公司（中国上海）提供。MCAO手术缝合线（A4，250–280 g）购自XINONG

通过SPR筛选鉴定来自Whitmania pigra的凝血酶结合肽LR

在我们之前的研究中，我们构建了一个来自Whitmania pigra的肽库（Hua等人，2025年）。为了鉴定针对凝血酶的抗凝候选肽，我们利用分子对接和动力学模拟筛选了与凝血酶具有高结合亲和力的肽。在筛选结果中，选择了一种序列为LRELEDALEQER的肽（以下简称LR肽）进行进一步研究。该肽富含酸性残基，并具有独特的空间结构

讨论

缺血性中风仍然是全球导致死亡和残疾的主要原因之一，其亚急性恢复期以持续的脑灌注不足和进行性的神经血管损伤为特征。在此阶段，高凝状态、微循环阻塞和持续的内皮功能障碍进一步加剧了初始缺血损伤引发的继发性神经元损伤。在中医理论中，“血瘀”被认为是核心病理机制

结论

LR肽在缺血性中风大鼠模型中表现出显著的神经保护作用。凭借其明显的抗凝和纤溶特性，它有效改善了脑灌注，减轻了缺血-再灌注损伤，并显示出良好的生物安全性。中等剂量即可提供稳定的治疗效果，支持其作为安全应用的可行性。总体而言，这些优势使LR肽成为预防和治疗缺血性中风的有希望的抗凝候选物

资助

本研究得到了以下资助：国家自然科学基金（编号82173955）。北京中医药大学重点项目：领导选拔与任命（2024-JYB-JBZD-063）。国家中医药管理局高水平重点学科建设项目（项目编号zyyzdxk-2023262）。北京中医药大学启黄英才计划（项目编号BUCM-2023KYBJRC-008）。

数据和材料的可用性

相关数据可应要求向通讯作者获取。

出版同意

所有作者均同意发表。

CRediT作者贡献声明

刘冉：写作 – 审稿与编辑，撰写原始稿件，软件使用，项目管理，方法学研究，数据分析，概念化。江新燕：数据可视化，验证，软件使用，资源提供。王子婷：数据可视化，验证，软件使用，资源提供。黄向宇：软件使用，资源提供，项目管理。马雅舒：软件使用，资源提供，项目管理。白尔娜·努尔迈迈提：方法学研究，数据分析。张晓：写作 – 审稿与

伦理批准和参与同意

本研究方案和知情同意书已获得北京中医药大学实验动物伦理委员会的批准（BUCM-1-2025032501-1021）。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。