破坏细胞结构的离子会改变专性嗜盐菌Aspergillus atacamensis的细胞壁结构：来自固态核磁共振（solid-state NMR）的研究发现

《Carbohydrate Polymers》：Chaotropic ions reshape the cell wall of the obligate halophile aspergillus atacamensis: Insights from solid-state NMR

真菌在极端高盐环境中生存依赖细胞壁多糖的结构适应，本研究利用多维固态核磁共振技术研究嗜盐真菌Aspergillus atacamensis在NaCl和MgCl2胁迫下的细胞壁重构机制，发现NaCl胁迫下细胞壁保持β-1,3-葡聚糖和壳聚糖为主的核心结构，而MgCl2胁迫导致多糖组成重组、细胞壁增厚和 hydration增强，揭示 kosmotropic与 chaotropic胁迫下不同的多糖重塑策略。

　　

Isha Gautam | Gisell Valdés Mu?oz | Aswath Karai | Jean-Paul Latgé | Yordanis Pérez-Llano | Nina Gunde-Cimerman | Ramón Alberto Batista-García | Tuo Wang

密歇根州立大学化学系，美国密歇根州东兰辛市

摘要

真菌在超高盐度环境中的生存需要其基于多糖的细胞壁具有特殊的适应性，但由于严格嗜盐真菌的极度稀有，这些适应性的分子机制仍大部分未知。Aspergillus atacamensis是一种严格嗜盐且耐混沌的真菌，能够在饱和NaCl浓度和异常高的MgCl₂水平下生长。本研究利用多维固态核磁共振（ssNMR）光谱技术，分析了在等渗NaCl和致乱MgCl₂条件下生长的、均匀标记有¹³C的A. atacamensis细胞中细胞壁多糖的分子结构、水合作用及动态变化。在NaCl条件下，细胞壁的核心主要由β-1,3-葡聚糖和几丁质构成。而高渗NaCl则导致细胞壁变薄、脱水，并增加了多糖的流动性。相比之下，MgCl₂暴露引起了细胞壁碳水化合物的显著重构，包括几丁质的出现、甘露聚糖进入刚性相、细胞壁厚度增加以及水合作用和动态变化的增强。这些发现揭示了真菌在应对等渗与致乱应力时不同的多糖重构策略，为理解其在极端离子环境中的生存机制提供了分子框架。

引言

在真菌中，只有少数物种被归类为严格嗜盐菌，包括Wallemia ichthyophaga、Wallemia muriae（J. Zajc, Kogej, Galinski, Ramos, & Gunde-Cimermana, 2014; Janja Zajc等人, 2013）、Aspergillus baarnensis（= Basipetospora halophila）、Aspergillus salinarus（Greiner, Per?oh, Weig, & Rambold, 2014）、Aspergillus destruens（Sklená?等人, 2017），以及最近的Aspergillus salisburgensis和Aspergillus atacamensis（Martinelli等人, 2017; Moreno-Perlin等人, 2023）。严格嗜盐菌在真菌界中的极度稀有性引发了关于其如何在超高盐度环境中生存的进化适应机制的基本问题（Gostin?ar, Zalar, & Gunde-Cimerman, 2022）。与能够在广泛盐度范围内生长的耐盐真菌不同，严格嗜盐菌的生长和代谢活动依赖于NaCl。这种依赖性表明它们的细胞壁具有特殊的机制，尤其是在高离子应力下仍需保持结构完整性（Gunde-Cimerman, Plemenita?, & Oren, 2018; Moreno-Perlin等人, 2023）。然而，关于真菌细胞壁在极端盐度下重构的直接结构证据仍然有限，这主要是由于缺乏能够在不破坏其天然结构的情况下进行原子级观察的高分辨率技术（Liyanage D Fernando等人, 2023; Kuncic, Kogej, Drobne, & Gunde-Cimerman, 2010）。

A. atacamensis EXF-6660最初是从阿塔卡马沙漠沿海山脉的一个受盐水影响的洞穴中分离出来的，它是研究真菌嗜盐性和耐混沌性的独特模型（Martinelli等人, 2017; Moreno-Perlin等人, 2023）。该物种在1.5 M至3.4 M NaCl浓度下生长最佳，并对多种等渗（稳定）和致乱（不稳定）盐类及溶质（如KCl、MgCl₂、CaCl₂、甘油和山梨醇）表现出显著的耐受性，但对LiCl的耐受性有限（最高至1.7 M）。与许多耐盐真菌不同，A. atacamensis能够在饱和NaCl浓度下繁殖，这一特性仅在少数极端嗜盐真菌物种（如Aspergillus sydowii和W. ichthyophagaHortaea werneckii中观察到（Gunde-Cimerman等人, 2018; Jiménez-Gómez等人, 2022; Moreno-Perlin等人, 2023; Janja Zajc等人, 2013）。此外，A. atacamensis还表现出代谢多样性，例如在2.0 M NaCl存在下能够降解多芳烃化合物和苯衍生物，这突显了其在生物技术应用中的潜力（Moreno-Perlin等人, 2023）。

A. atacamensis最引人注目的特点是其在致乱应力条件下的生存能力，这是真菌研究中一个尚未充分探索的领域（González-Abradelo等人, 2025; Lever, 2016）。在水溶液中，致乱剂如MgCl₂通过干扰水结构来破坏大分子的稳定性，而等渗剂如NaCl通常能稳定生物分子（Cray等人, 2013; Hallsworth等人, 2007）。然而，在高浓度下，NaCl也会产生致乱效应，改变蛋白质的溶解性、膜完整性和细胞结构，这与深海盐水和富含镁的超高盐度湖泊中的情况类似（Hallsworth等人, 2007; Yakimov等人, 2015）。尽管W. ichthyophaga、H. werneckii和A. sydowii等真菌对多种盐类（包括高浓度MgCl₂）表现出极强的耐受性，但耐盐真菌对MgCl₂压力的生理、结构和分子响应仍完全未知（González-Abradelo等人, 2025）。值得注意的是，A. atacamensis已被记录能在MgCl₂浓度（2.1 M）下生长（Moreno-Perlin等人, 2023），远超先前认为的微生物生存极限（1.26 M，Hallsworth等人, 2007），这表明其具有值得进一步研究的独特细胞适应机制。

了解极端嗜盐真菌如何在这些极端盐度条件下重构其细胞壁是微生物适应性的一个基本但未被充分研究的方面（Gunde-Cimerman等人, 2018）。真菌细胞壁作为细胞与其环境之间的主要界面，在维持渗透平衡、提供机械稳定性和调节应激反应方面起着关键作用（Ene等人, 2015; Garcia-Rubio, de Oliveira, Rivera, & Trevijano-Contador, 2020）。高盐浓度已知会影响关键结构成分（如葡聚糖、几丁质和几丁聚糖）的生物合成和重构（Fuchs & Mylonakis, 2009），但在极端条件下细胞壁重构的直接证据仍然很少。大多数关于真菌渗透适应性的研究集中在兼容溶质和细胞内信号通路上（Gostin?ar等人, 2022; Gunde-Cimerman等人, 2018），而对细胞壁物理和生化性质如何改变以承受超高盐度应力的关注较少。

分析真菌细胞壁多糖面临重大挑战，因为它们的组成复杂且不溶于水。传统的生化方法包括细胞壁分离、溶解和化学分级以表征结构成分（Aimanianda等人, 2017; Bekirian等人, 2024; Black等人, 2023; Fontaine等人, 2000; Gravelat等人, 2013; J. P. Latgé, 2007）。然而，最近的高分辨率生物物理技术（如固态核磁共振（ssNMR）、冷冻电子显微镜（CryoEM）和动态核极化（DNP）的进步，能够在不破坏细胞天然结构的情况下提供原子级别的见解（Deligey等人, 2022; I. Gautam等人, 2025, Gautam等人, 2025; N. A. R. Gow & Lenardon, 2023; J.P. Latgé & Wang, 2022; Lenardon, Sood, Dorfmueller, Brown, & Gow, 2020; Su, Andreas, & Griffin, 2015）。特别是多维ssNMR光谱技术，能够直接分析完整细胞中的生物分子相互作用、水合作用动态和聚合物组织，使其成为研究极端嗜盐真菌在压力条件下的强大工具（Ghassemi等人, 2022; Polenova, Gupta, & Goldbourt, 2015; Reif, Ashbrook, Emsley, & Hong, 2021）。这些方法最初应用于植物生物质、细菌细胞壁和生物膜以及其他细胞外基质（Bougault等人, 2020; Byeon等人, 2023; Rampratap等人, 2024; Reichhardt & Cegelski, 2014; Schanda等人, 2014; Takahashi等人, 2013; Vallet等人, 2024; Xue, Yu, Ouyang, Huang, & Kang, 2024），现已扩展到真菌细胞壁研究，揭示了病原真菌和工业相关物种的结构适应性（Ankur等人, 2025; Chatterjee, Prados-Rosales, Itin, Casadevall, & Stark, 2015; Ehren等人, 2020; Jacob等人, 2025; Kang等人, 2018; Lamon等人, 2023; Lends等人, 2025; Safeer等人, 2023; Singh, Massam-Wu, Balasubramanian, & Chow, 2025）。

尽管有这些技术进步，但关于极端嗜盐真菌如何在超高盐度和致乱条件下重构细胞壁的研究几乎不存在。迄今为止，只有少数报告探讨了严格嗜盐和耐混沌真菌的细胞壁重构（Liyanage D Fernando等人, 2023）。鉴于A. atacamensis在极端等渗和致乱应力条件下的生存能力，本研究首次在分子水平上高分辨率地分析了其在MgCl₂引起的极端致乱条件下的细胞壁结构。

在本研究中，使用ssNMR光谱技术分析了A. atacamensis的完整细胞，详细研究了其在等渗和致乱应力下细胞壁多糖的组成、动态和水合作用的变化。均匀标记有¹³C、¹⁵N的A. atacamensis细胞在最佳和诱导应力的NaCl和MgCl₂浓度下经历了高渗冲击。虽然NaCl对细胞壁组成的影响很小，但MgCl₂引发了显著的结构适应，导致细胞壁变得更厚、更湿润且更具动态性，表现为几丁质和甘露聚糖含量减少以及几丁质的出现。这项研究提供了关于严格嗜盐和耐混沌真菌如何响应极端环境压力重构细胞壁的前所未有的细节，为开发耐盐真菌菌株和生物材料用于生物技术应用提供了基础。

章节片段

真菌菌株、培养和同位素标记

本研究中使用的极端嗜盐真菌菌株是A. atacamensis EXF-6660，它来自智利阿塔卡马沙漠沿海山脉的一个洞穴中的盐水中（Martinelli等人, 2017）。该菌株在添加了1.7 M NaCl的土豆葡萄糖琼脂（PDA，Catalog # CM0139B，Thermo Fisher Scientific）上培养和维持，这一盐浓度被确定为其最佳生长条件（Martinelli等人, 2017）。

结果与讨论

在NaCl应力下A. atacamensis细胞壁的重组刚性核心。

我们使用A. atacamensis作为模型嗜盐菌，研究了其在1.7 M NaCl最佳钠氯化物条件下的菌丝特征。培养时间为7天，处于指数生长阶段，足以产生足够的生物量进行ssNMR分析（Moreno-Perlin等人, 2023）。还研究了5.13 M NaCl的高渗冲击条件，并收集了样本。

结论

本研究从分子层面描述了严格嗜盐真菌如何在极端等渗和致乱环境中重构其基于碳水化合物的细胞壁。通过使用完整细胞的固态核磁共振技术，我们证明A. atacamensis在广泛的NaCl浓度范围内保持以β-1,3-葡聚糖和几丁质为主的刚性核心。相比之下，MgCl₂暴露引发了细胞壁碳水化合物的显著重构，包括部分几丁质的脱乙酰化。

缩写

CORD　COmbined R2ⁿν-Driven

CP　交叉极化

CryoEM　冷冻电子显微镜

DP　直接极化

GAG　半乳胺聚糖

GM　半乳甘露聚糖

INADEQUATE　Incredible Natural Abundance DoublE QUAntum Transfer Experiment

MAS　魔角旋转

TEM　透射电子显微镜

作者贡献声明

Isha Gautam：撰写——原始草稿、研究、数据分析。 Gisell Valdés Mu?oz：撰写——审阅与编辑、研究、数据分析。 Aswath Karai：撰写——审阅与编辑、研究。 Jean-Paul Latgé：撰写——审阅与编辑、概念化。 Yordanis Pérez-Llano：研究。 Nina Gunde-Cimerman：撰写——审阅与编辑、资源获取。 Ramón Alberto Batista-García：撰写——审阅与编辑、资金获取、概念化。 Tuo Wang：撰写——审阅与

利益冲突声明

作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：Tuo Wang报告获得了美国国立卫生研究院（NIH）的财务支持。Ramon Alberto Batista-Garcia报告获得了欧洲社会基金Plus的财务支持。如果还有其他作者，他们声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本研究报告的工作。

致谢

本工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）的R01AI173270项目的支持。此外，该工作还得到了MCIN/AEI资助的RYC2022-037554-I项目（10.13039/501100011033）和FSE+（RAB-G）的支持。墨西哥政府科学、人文、技术及创新部（SECIHTI）也提供了支持，包括项目1059、315114和SEP-CB-285816（RAB-G）。本工作还得到了斯洛文尼亚研究机构对Infrastuctural Centre Mycosmo的支持。