《Experimental & Molecular Medicine》：A ESRP1/circPHGDH/miR-149/RAP1B positive feedback loop promotes the malignant behaviors and glycolysis of prostate cancer cell
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为解决前列腺癌（PCa）进展及治疗抵抗的难题，本研究聚焦circPHGDH的功能与调控机制。研究揭示，剪接因子ESRP1通过乳酸化修饰被稳定，促进致癌circRNA circPHGDH的生成；后者通过吸附miR-149上调RAP1B，激活PI3K/AKT通路，从而驱动PCa细胞的增殖、迁移、侵袭、上皮间质转化（EMT）及糖酵解。此发现为PCa提供了新的治疗靶点。
前列腺癌（Prostate Cancer， PCa）是男性最常见的恶性肿瘤之一，尤其高发于老年男性。尽管现有治疗手段，如手术、放疗和激素疗法等，已显著改善了患者生存，但肿瘤异质性、治疗抵抗和复发仍是临床面临的严峻挑战。早期诊断也因疾病初期无症状而困难重重。因此，深入探究PCa发生发展的分子机制，寻找新的有效治疗靶点，成为当前研究的重中之重。
近年来，一类被称为环状RNA（circular RNA， circRNA）的非编码RNA分子在癌症研究中备受关注。与线性RNA不同，circRNA呈共价闭合环状结构，稳定性更高。它们能在细胞中充当“海绵”，吸附微小RNA（microRNA， miRNA），从而解除miRNA对其靶基因的抑制，影响肿瘤进程。然而，许多circRNA在PCa中的具体功能和生成机制仍不清楚。与此同时，肿瘤细胞的代谢重编程，特别是对糖酵解的过度依赖（即“瓦博格效应”），为肿瘤快速生长提供了能量和原料。糖酵解的终产物乳酸，近年来被发现可作为新型翻译后修饰——乳酸化（lactylation）的底物，影响蛋白功能与稳定性，这可能将肿瘤代谢与基因表达调控紧密联系起来。
那么，是否存在特定的circRNA，能够将PCa中的异常剪接、代谢重编程和恶性表型串联起来？这成为了研究人员想要解答的核心科学问题。
为了回答这个问题，研究人员开展了一项主题为“ESRP1/circPHGDH/miR-149/RAP1B正反馈环路促进前列腺癌细胞恶性行为及糖酵解”的研究。他们发现了一个名为circPHGDH（由PHGDH基因的第11和12外显子环化形成）的circRNA在PCa组织和细胞中表达上调。功能实验表明，敲低circPHGDH能显著抑制PCa细胞的增殖、迁移、侵袭、上皮-间质转化（Epithelial–Mesenchymal Transition， EMT）和糖酵解能力，而过表达则促进这些表型。进一步的机制探索揭示，circPHGDH在细胞质中作为“分子海绵”吸附了miR-149，而miR-149的下游直接靶基因是RAP1B。circPHGDH通过这一轴线上调了RAP1B的表达，进而激活了致癌的PI3K/AKT信号通路。更有趣的是，研究还发现circPHGDH自身的生成受剪接因子ESRP1调控，而糖酵解产生的乳酸能够通过促进ESRP1蛋白第43位赖氨酸（K43）的乳酸化修饰来稳定ESRP1。反过来，circPHGDH敲低导致的糖酵解抑制，又会减少ESRP1的乳酸化和稳定性。这就形成了一个“乳酸化修饰的ESRP1 → 促进circPHGDH生成 → circPHGDH/miR-149/RAP1B轴促进糖酵解 → 产生乳酸 → 乳酸化并稳定ESRP1”的正反馈环路，持续驱动PCa的恶性进展。这项研究为理解PCa的发病机制提供了全新视角，并指出了ESRP1/circPHGDH/miR-149/RAP1B轴作为潜在治疗靶点的重要价值。相关论文发表在《Experimental & Molecular Medicine》期刊上。
为了开展这项研究，作者主要应用了以下几项关键技术方法：首先，通过生物信息学分析公共基因表达数据集（GEO中的GSE113153）筛选PCa中差异表达的circRNA。其次，收集了51对PCa患者癌组织与癌旁组织临床样本进行验证。在细胞功能层面，使用了集落形成、Transwell小室、Seahorse能量代谢分析等技术评估细胞增殖、迁移侵袭和糖酵解能力；通过蛋白质印迹（Western Blotting）检测EMT标志物及信号通路蛋白。在分子机制验证上，采用了荧光原位杂交（FISH）进行RNA亚细胞定位；利用RNA免疫共沉淀（RIP）、RNA Pull-down及双荧光素酶报告基因实验验证RNA与蛋白、RNA与RNA之间的相互作用；通过免疫共沉淀（IP）和定点突变技术研究ESRP1的乳酸化修饰位点。最后，通过构建裸鼠皮下移植瘤模型，在体内验证了circPHGDH/miR-149/RAP1B轴对肿瘤生长和转移的调控作用。
研究结果
Identification of circPHGDH in PCa
研究人员通过微阵列分析，在高级别与低级别PCa中筛选出差异表达的circRNA，并选择了circ_0000121（即circPHGDH）进行后续研究。验证实验证实circPHGDH具有典型的环状RNA特征：对RNase R处理不敏感、半衰期长于其线性母本PHGDH mRNA、并且主要定位于细胞质。这些结果表明circPHGDH是PCa细胞中一个稳定存在的经典circRNA。
CircPHGDH promotes PCa cell proliferation, migration, invasion, EMT and glycolysis
临床样本分析显示，circPHGDH在PCa组织中表达显著上调，且其高表达与更大的肿瘤体积、更高的T分期和远处转移相关。在PCa细胞系中敲低circPHGDH，能够抑制细胞的集落形成、迁移、侵袭，上调上皮标志物E-cadherin、下调间质标志物N-cadherin（即抑制EMT），并降低细胞外酸化率（ECAR）、提高耗氧率（OCR），表明糖酵解被抑制。而过表达circPHGDH则产生相反的效果。这证明circPHGDH在PCa中发挥促癌作用。
CircPHGDH is a miR-149 sponge in PCa cells
机制上，双荧光素酶报告基因和RNA Pull-down实验证实circPHGDH可直接结合miR-149。circPHGDH的表达与miR-149呈负相关，且circPHGDH敲低会上调miR-149表达。FISH实验显示两者在细胞质中共定位。这些结果说明circPHGDH作为miR-149的分子海绵发挥作用。
MiR-149 targets RAP1B in PCa cells
通过生物信息学预测和实验验证，研究人员发现miR-149可直接靶向RAP1B基因的3‘非翻译区（3’-UTR）。RAP1B在PCa中高表达，且与miR-149表达负相关。circPHGDH敲低导致的RAP1B下调可被miR-149抑制剂所逆转。此外，过表达RAP1B能激活PI3K/AKT信号通路。这些数据确立了miR-149/RAP1B/PI3K/AKT这一下游轴。
ESRP1 promotes circPHGDH biogenesis
上游机制研究发现，剪接因子ESRP1能特异性促进circPHGDH的生成。RIP和RNA Pull-down实验证明ESRP1蛋白与circPHGDH及其侧翼内含子中的特定基序结合。突变这些结合位点会消除ESRP1对circPHGDH生成的促进作用。这表明ESRP1是circPHGDH生物发生的关键调控因子。
Knockdown of circPHGDH inhibits lactylation of ESRP1 at K43 site in PCa cells
研究进一步发现，糖酵解产物乳酸（L-lactic acid， LA）处理能增加ESRP1的蛋白水平和乳酸化修饰，并延长其半衰期；而敲低circPHGDH则产生相反效果。通过定点突变，研究人员确认K43是ESRP1发生功能性乳酸化的关键位点。这揭示了代谢产物如何通过翻译后修饰影响剪接因子稳定性。
ESRP1 promotes the malignant behaviors of PCa cells by increasing circPHGDH expression
功能挽救实验表明，ESRP1过表达所促进的PCa细胞增殖、迁移、侵袭、EMT和糖酵解，可被同时敲低circPHGDH所抵消。这说明ESRP1的促癌作用至少部分是通过上调circPHGDH实现的。
Silencing of circPHGDH inhibits tumor growth and metastasis in vivo by regulating the miR-149/RAP1B axis
体内实验证实，在裸鼠移植瘤模型中，敲低circPHGDH能抑制肿瘤的生长、转移（生物发光信号减弱）和细胞增殖标志物Ki-67的表达。而同时在瘤内抑制miR-149或过表达RAP1B，则能够逆转敲低circPHGDH产生的抑瘤效果，有力证明了circPHGDH通过miR-149/RAP1B轴在体内驱动PCa进展。
研究结论与讨论
本研究系统性地揭示了一个驱动前列腺癌恶性进展的全新正反馈调控环路。该环路的核心在于：剪接因子ESRP1促进致癌环状RNA circPHGDH的生成；circPHGDH通过吸附miR-149，解除其对下游靶基因RAP1B的抑制，进而激活PI3K/AKT信号通路，最终导致PCa细胞增殖、迁移、侵袭、上皮-间质转化（EMT）及糖酵解能力的增强。尤为关键的是，增强的糖酵解产生大量乳酸，乳酸作为底物催化了ESRP1蛋白在K43位点的乳酸化修饰，从而稳定了ESRP1蛋白，使其能够持续促进circPHGDH的生成，形成一个自我放大的“引擎”。
这一发现具有多重重要意义。首先，它首次将剪接调控（ESRP1）、非编码RNA网络（circPHGDH/miR-149）、信号通路（RAP1B/PI3K/AKT）和肿瘤代谢重编程（糖酵解/乳酸化）这几个PCa研究的关键领域有机地整合到一个连贯的分子框架中，为理解PCa的高度复杂性和异质性提供了新的视角。其次，研究鉴定了circPHGDH、ESRP1乳酸化修饰等新的分子事件和调控节点，这些都可能成为潜在的、用于PCa诊断或预后判断的生物标志物。最后，也是最具转化医学价值的一点，该正反馈环路中的多个环节，如circPHGDH本身、ESRP1的乳酸化、RAP1B等，均可作为药物干预的靶点。针对这些靶点开发小分子抑制剂、寡核苷酸药物（如靶向circPHGDH的siRNA或ASO）或阻断乳酸化过程的化合物，有望能够切断这一致癌环路，为克服PCa的治疗抵抗和预防转移提供新的策略。因此，这项研究不仅深化了对PCa发病机制的基础认识，也为开发更有效的精准治疗方案奠定了坚实的理论基础。
