黑磷纳米片在结直肠癌中对特定细胞类型的杀伤作用：揭示ADIPOQ-氧化还原稳态轴的机制

《Chemico-Biological Interactions》：Cell-type-specific killing by black phosphorus nanosheets in colorectal cancer: unraveling the ADIPOQ-redox homeostasis axis

选择性靶向结直肠癌细胞的黑磷纳米片通过调控ADIPOQ基因和PPARγ/RXRα信号通路诱导氧化应激和凋亡，同时 sparing正常肠细胞。

　　

刘大旭|赵青|王胜楠|徐宇泽|涂赵旭|邓硕|张思宇|张学娇

沈阳药科大学，中国辽宁省沈阳市110016

摘要

黑磷纳米片（BPNSs）在生物医学领域的新兴应用为癌症治疗提供了新的可能性。本研究探讨了BPNSs对结肠直肠癌细胞（Caco-2）与正常肠道细胞（FHC）的选择性作用及其潜在机制。在浓度超过4 μg/mL时，BPNSs通过诱导凋亡选择性杀死Caco-2细胞，而FHC细胞主要在较高浓度下发生坏死。结合生物信息学、转录组学和生化检测的结果表明，BPNSs的选择性杀伤作用归因于Caco-2细胞中氧化应激相关基因ADIPOQ的特异性下调。这种下调是由于PPARγ/RXRα复合物形成的破坏导致的，进而引起ADIPOQ和PPARα表达减少、过氧化物酶体增殖受损，最终导致氧化应激和细胞死亡。BPNSs引发的氧化应激还会造成DNA损伤并激活P53通路，从而诱导Caco-2细胞凋亡。本研究阐明了BPNSs选择性杀伤的细胞类型依赖性机制，为BPNSs在靶向结肠直肠癌治疗中的应用提供了理论依据。

引言

结肠直肠癌（CRC）是全球主要的健康挑战之一，其发病率在所有癌症中排名第三，死亡率排名第二[1]、[2]。2022年，CRC新增病例超过200万例，死亡人数约为96.9万例，占全球癌症病例和死亡人数的约10%[3]。因此，有效的筛查和治疗策略对于减轻这一负担至关重要。虽然化疗仍是CRC治疗的基石，但其疗效常常受到药物溶解度低和缺乏肿瘤特异性的限制[4]。为此，人们开发了多种药物递送系统以提高化疗药物的水溶性和靶向能力[5]、[6]。然而，这些载药系统在实际应用于CRC治疗时仍面临挑战，包括复杂的制备过程以及药物与纳米载体在生物环境中的不良相互作用[7]。

生物活性纳米材料，如金纳米颗粒、石墨烯、碳纳米管、氧化铈纳米颗粒和纳米酶，具有内在的治疗特性，在治疗癌症、炎症性疾病和神经退行性疾病等方面显示出潜力[8]、[9]、[10]。对于这类化疗纳米材料而言，区分癌细胞和正常细胞的能力至关重要，以减少全身毒性和不良反应。

在这些生物活性纳米材料中，黑磷纳米片（BPNSs）相较于石墨烯和碳纳米管具有明显优势，如更好的生物相容性、易于功能化以及更高的靶向特异性[11]、[12]。这些特性使BPNSs成为癌症治疗的高度有希望的候选材料。例如，Yu等人发现，BPNSs对癌细胞的IC50值在48小时内均低于2 μg/mL，而对正常细胞的IC50值无法计算，这证明了BPNSs在正常细胞中的良好生物相容性，体现了其选择性毒性[13]、[14]。这促使了“生物活性磷基疗法”（BPT）的发展[11]，该疗法在肺癌、乳腺癌和结肠直肠癌的治疗中展现出显著潜力。

目前对BPNSs选择性杀伤癌细胞的理解认为，其机制源于肿瘤细胞相对于正常细胞更高的代谢率和氧化能力[15]、[16]。肿瘤细胞通过内吞作用大量摄取BPNSs并迅速降解它们，导致细胞质磷酸根离子浓度升高、活性氧（ROS）水平增加，进而引发氧化应激介导的细胞死亡[17]、[18]。然而，这种选择性效应的精确分子机制，尤其是在具有独特代谢特征、基因突变和表观遗传改变的CRC背景下，仍不明确。这些CRC的固有特性不仅推动了肿瘤进展，还影响了细胞对治疗的反应。因此，开发能够选择性靶向CRC细胞而不伤害正常细胞的治疗药物仍是肿瘤学研究的重要目标。

基于上述概念进展，近期研究显著扩展了BPNSs的生物医学应用潜力。例如，Zhou等人证明表面氧化的BPNSs可作为模拟过氧化物酶的纳米酶来增强细胞内的氧化应激[19]；Wang等人开发了一种基于BPNSs的比率荧光探针，用于实时监测活体癌细胞中的ROS爆发[20]；Sun的研究团队发现过渡金属掺杂可以提高BPNSs的光热转换效率而不影响其生物相容性[21]；Chen等人将BPNSs与分子印迹聚合物结合，用于靶向识别循环肿瘤细胞[22]。值得注意的是，Zhang等人的综述指出，尽管BPNSs对多种肿瘤具有选择性细胞毒性，但决定这种细胞类型特异性的具体分子因素仍不清楚[23]。

在本研究中，我们重点探讨了BPNSs对结肠直肠癌细胞（Caco-2）与正常肠道细胞（FHC）选择性杀伤的分子机制。通过生物信息学和转录组学分析，我们确定ADIPOQ（一种关键抗氧化基因[24]）是这种选择性杀伤的关键介质。进一步使用体外和体内模型验证了BPNSs与Caco-2细胞的相互作用机制。我们的发现揭示了一种细胞类型特异性的杀伤机制，为BPNSs在靶向癌症治疗中的应用提供了重要的科学依据。这项工作还强调了理解纳米-生物相互作用的医学重要性，有助于未来纳米药物的研发。

实验方法片段

RNA提取和实时荧光定量PCR（qPCR）

Caco-2细胞和FHC细胞均培养在6孔板中，并用4 μg/mL的BPNSs处理24小时。使用TransZol? Up plus RNA Kit（TAKARA，日本）将RNA逆转录为cDNA。随后，将cDNA样本送至LightCycler 96实时荧光定量PCR（qPCR）系统（Roche，美国）进行扩增。qPCR反应程序包括30个循环：94°C变性30秒、56°C退火30秒、72°C延伸30秒。

BPNSs对Caco-2细胞的选择性杀伤

使用RTCA评估BPNSs对Caco-2细胞和FHC细胞生长的影响。暴露24小时后，1 μg/mL和2 μg/mL浓度的BPNSs对Caco-2细胞没有显著毒性，但在4 μg/mL浓度下诱导了超过50%的细胞死亡，平均log2倍变化（log?FC）为-1.894，95%置信区间为-3.528至-0.2593，p=0.0324。相比之下，即使在最高实验浓度8 μg/mL下，FHC细胞也表现出良好的耐受性（图1A和B）。

结论

本研究确定了BPNSs诱导结肠直肠癌细胞Caco-2程序性凋亡的阈值浓度，同时揭示了这种作用在体外和体内的分子机制（图S8）。关键抗氧化基因ADIPOQ被确定为选择性毒性的生物标志物。我们的发现表明，BPNSs通过抑制PPARγ/RXRα复合物的组装来特异性下调Caco-2细胞中的ADIPOQ表达，从而导致PPARα表达减少。

CRediT作者贡献声明

张学娇：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、实验设计、资金申请、数据分析。赵青：撰写——审稿与编辑、实验设计、资金申请。刘大旭：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、实验设计、数据分析。徐宇泽：撰写——审稿与编辑。王胜楠：撰写——审稿与编辑。涂赵旭：撰写——审稿与编辑。张思宇：撰写——审稿与编辑。

利益冲突声明

? 作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本工作得到了国家重点研发计划（2023YFC3708700）、国家自然科学基金（编号42192574、42277423、42377417、22176196）、广东省基础与应用基础研究重大项目（2023B0303000006）、广东省科技发展项目（2022GDASZH-2022010105、2023GDASQNRC-0106、2023GDASQNRC-0103、2020GDASYL-20200101002）以及广东省科学技术研究基金（资助编号）的支持。