Cx3cr1的缺失可以改善由二氧化硅引起的脂质代谢紊乱和肺纤维化

《Chemico-Biological Interactions》：Cx3cr1 depletion ameliorates lipid metabolic dysregulation and pulmonary fibrosis induced by silica

硅肺小鼠模型中Cx3cr1通过调控肺巨噬细胞脂代谢影响肺纤维化进程，敲除该基因可减轻纤维化。单细胞测序和体外实验证实Cx3cr1介导脂质蓄积及促纤维化因子释放。孟德尔随机化支持CX3CR1与尘肺症关联。

　　

作者列表：胡恩娜（Enna Hu）、王怡茹（Yiru Wang）、李哲辰（Zhechen Li）、张嘉欣（Jiaxin Zhang）、黄伟凡（Weifan Huang）、沈志辉（Zhonghui Zhu）、刘代林（Dailin Liu）、朱忠辉（Zhonghui Zhu）、田琳（Lin Tian）、王燕（Yan Wang）

北京安贞医院，首都医科大学，中国北京100029

摘要

矽肺病的特征是肺纤维化，目前尚无有效的治疗方法。巨噬细胞脂质代谢的紊乱在肺纤维化的发病机制中起着关键作用，但其背后的分子机制仍不清楚。在本研究中，我们发现矽肺病小鼠模型中的Cx3cr1基因是肺巨噬细胞脂质代谢的关键基因，抑制Cx3cr1的表达可以改善矽尘引起的肺纤维化，可能是通过抑制脂质代谢紊乱实现的。首先，通过对矽肺病小鼠模型的肺巨噬细胞进行转录组分析，确定了Cx3cr1作为一个潜在的关键调控基因。随后，通过流式细胞术分离出Cx3cr1⁺巨噬细胞，并通过Ingenuity Pathway Analysis（IPA）等综合分析方法发现，Cx3cr1可能通过干扰肺巨噬细胞的脂质代谢来促进矽肺纤维化。在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型中，单细胞RNA测序和伪时间轨迹分析进一步证实了Cx3cr1在肺巨噬细胞脂质代谢中的作用。体内敲除Cx3cr1后，脂质积累减少，促炎和促纤维化介质的水平降低，矽尘诱导的肺纤维化得到抑制。此外，还在RAW264.7细胞和骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）中敲除了Cx3cr1基因，然后用矽尘和氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）刺激这些细胞。体外实验结果表明，抑制Cx3cr1的表达可以改善巨噬细胞的脂质代谢紊乱。Mendelian Randomization（MR）分析也表明Cx3CR1是尘肺病的风险因素。总体而言，这些结果表明，靶向抑制Cx3cr1可能为纠正巨噬细胞脂质代谢紊乱和减轻矽尘引起的肺纤维化提供一种潜在的治疗途径。

引言

矽肺病是全球最常见的职业病之一，由长期吸入可吸入的结晶矽尘引起[1]、[2]、[3]、[4]。其病理特征是广泛的肺间质纤维化和散在的矽肺结节[5]、[6]。临床上，矽肺病患者通常会出现进行性的呼吸功能障碍、低氧血症和呼吸衰竭[7]、[8]、[9]。值得注意的是，即使停止接触矽尘，疾病仍会继续进展，工人离开粉尘环境后肺功能也会继续下降。鉴于矽肺病的高发病率和死亡率，它对职业健康构成了重大威胁，并给医疗系统带来了巨大负担[10]。尽管进行了大量研究，但其发病机制仍未完全明了，现有的治疗方法既不能阻止也不能逆转矽尘引起的肺纤维化。因此，进一步研究其发病机制对于预防和治疗矽肺病至关重要。

目前，脂质代谢紊乱在矽肺病纤维化的发生中起着重要作用。组学研究显示，人类患者和小鼠矽肺病模型的肺组织和血清中的脂肪酸代谢途径发生了改变[11]、[12]。此外，在矽肺病患者的支气管肺泡灌洗液（BALF）中发现了富含脂质的巨噬细胞（LLMs），体外研究表明这些细胞中的促纤维化细胞因子TGF-β水平升高[13]。类似的巨噬细胞也在肺部感染和其他纤维化肺部疾病中被观察到[14]、[15]。它们在多种疾病中的存在表明，细胞内脂质积累是一个共同特征，可能重新编程巨噬细胞的功能，从而驱动炎症和纤维化反应。

在生理条件下，由于肺表面活性剂的存在，肺巨噬细胞处于一个富含脂质的环境中。它们不断清除氧化和受损的脂质，维持脂质摄取和排泄之间的动态平衡。然而，肺损伤引起的氧化应激会增加受损脂质的产生，巨噬细胞通过清除受体（SRs）过度摄取这些脂质，导致LLMs的形成[16]。这些LLMs随后释放多种细胞因子，引发炎症或纤维化[17]。此外，LLMs还与肝脏的血管周围纤维化有关[18]，通过分泌细胞因子促进动脉粥样硬化斑块中的纤维帽形成[19]，并在Erdheim-Chester病中密集浸润纤维化病变[20]。综上所述，来自这些不同器官系统的证据表明，纤维化与脂质过载之间存在密切关联，提示LLMs的形成可能是矽肺病纤维化的潜在起始事件。然而，如何防止肺组织中富含脂质的巨噬细胞的形成从而减轻肺纤维化，目前尚不清楚。

在本研究中，我们对小鼠肺组织中的巨噬细胞进行了流式细胞术分离，并对矽尘暴露组和对照组之间差异表达的基因（DEGs）进行了蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析。有趣的是，Cx3CR1（C-X3-C基序趋化因子受体1）在PPI网络中成为一个枢纽基因，并通过STRING数据库预测其与TREM2相互作用。鉴于TREM2在肺巨噬细胞病理脂质代谢中的作用[21]、[22]、[23]，我们推测Cx3cr1也可能在矽肺病纤维化过程中影响巨噬细胞的脂质沉积。

CX3CR1是一种趋化因子受体，通过与内源性配体CX3CL1的特异性结合来介导免疫细胞的迁移、黏附和炎症反应。它主要表达在单核细胞、NK细胞、T淋巴细胞和肥大细胞上[24]。Cx3cr1与肺纤维化有关，在博来霉素诱导的模型中，Cx3cr1⁺巨噬细胞会招募并定位到纤维化微环境中[25]、[26]；而在心脏中，Cx3cr1⁺髓系细胞通过促进与成纤维细胞的促纤维化通讯来驱动心脏纤维化[15]、[25]。与以往主要强调Cx3CR1趋化性和迁移作用的研究不同，本研究关注其作为潜在代谢调节因子的作用。值得注意的是，Cx3cr1还与富含脂质的巨噬细胞的生成密切相关。研究表明，Cx3cr1⁺巨噬细胞会摄取内膜下的脂质并转化为泡沫细胞，促进动脉粥样硬化斑块的形成[27]，而Cx3cr1的敲除可以减轻这种病理变化[28]。然而，Cx3cr1是否在矽肺病纤维化中调节巨噬细胞的脂质沉积，以及这种机制是否促进疾病进展，目前仍不明确。本研究旨在明确Cx3cr1如何影响矽肺病中的富含脂质的巨噬细胞的形成及其促纤维化表型，从而确定Cx3cr1作为肺纤维化潜在代谢调节因子的作用，并为未来的机制研究和治疗提供基础。

部分内容摘要

矽尘

矽尘（S5641）购自Sigma公司，纯度约为99%，其中80%的颗粒直径小于5 μm。用于体内实验时，将矽尘悬浮在生理盐水（0.9%NaCl）中，浓度为50 mg/ml，然后在灌肠前进行高压灭菌。用于体外实验（使用骨髓来源的巨噬细胞和RAW264.7细胞）时，将矽尘配制成2 mg/ml的储备溶液，同样使用磷酸盐缓冲盐水（PBS）。

转录组分析显示矽尘暴露后Cx3cr1在肺巨噬细胞中是一个枢纽基因

为了研究矽尘暴露对肺巨噬细胞的影响，我们通过流式细胞术从小鼠肺组织中分离出肺泡巨噬细胞（AMs）和间质巨噬细胞（IMs）（图1A）。RNA提取和测序后，主成分分析（PCA）显示矽尘暴露组在AMs和IMs中形成了与对照组不同的簇（图1B）。接着，我们识别了矽尘组与对照组之间AMs和IMs中的差异表达基因（DEGs）。

讨论

巨噬细胞是矽肺病发病机制中的关键介质，传统上认为它们通过分泌细胞因子和激活靶细胞（如成纤维细胞）来发挥作用[55]。新的证据表明，这些细胞内的脂质沉积进一步通过驱动炎症和纤维化促进疾病进展[56]。然而，富含脂质的巨噬细胞的上下游调控分子尚未明确。在本研究中，我们基于MR分析、多组学数据等提供了全面的证据。

CRediT作者贡献声明

胡恩娜（Enna Hu）：撰写初稿、数据可视化、方法学设计、实验实施、数据分析、概念构思。王怡茹（Yiru Wang）：撰写、审稿与编辑、数据可视化、实验设计。王燕（Yan Wang）：撰写、审稿与编辑、项目监督、资源协调、资金获取、概念构思。张嘉欣（Jiaxin Zhang）：数据可视化、方法学设计、实验实施。黄伟凡（Weifan Huang）：实验实施。李哲辰（Zhechen Li）：撰写、审稿与编辑、数据可视化、软件操作、数据整理。朱志辉（Zhonghui Zhu）：

资助

本研究得到了国家自然科学基金（编号：82073498、82473603）和北京市自然科学基金本科生“启动研究”计划（编号：QY25423）的支持。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

我们感谢北京大学胡安（Huan Yang）在流式细胞术细胞分离方面的出色技术支持。