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本文研究发现，Rett综合征患者iPS细胞衍生的内皮细胞存在miR-126-3p异常上调，导致Ang2/Tie2通路紊乱和血管屏障功能损伤。通过CRISPR/Cas9构建ETV2诱导型iPS细胞系并利用微流控3D血管网络模型，研究人员证实下调miR-126-3p可恢复紧密连接蛋白表达并改善血管通透性。该研究首次揭示了MeCP2突变通过miR-126调控血管完整性的新机制，为Rett综合征及其他神经发育/退行性疾病的血管靶向治疗提供了新策略。
在大脑这个精密的控制中心里，维持内部环境稳定的“守护神”是血脑屏障。这道由血管内皮细胞紧密连接构成的屏障，严格筛选着进出大脑的物质，是大脑健康运行的关键防线。然而，在一些神经发育性疾病中，这道防线可能出现了我们尚未完全了解的漏洞。Rett综合征就是这样一种由X染色体上MeCP2基因突变导致的严重神经发育障碍，患者会出现语言和社交能力丧失、运动异常和认知障碍等症状。传统上，研究主要聚焦于MeCP2突变对神经元和神经胶质细胞的直接影响。然而，MeCP2蛋白在大脑的非神经细胞，包括构成血管壁的内皮细胞中也有表达。临床上，Rett综合征患者常伴有生长迟缓、大脑特定区域灌注不足和循环不良等现象，这强烈暗示着大脑微血管系统可能也受到了损害。血管的形成和分化是大脑发育过程中最早发生的事件之一，甚至早于神经发生。因此，发育早期的血管改变，可能会对后续的神经发育进程产生广泛而深远的影响。那么，一个核心问题摆在面前：MeCP2突变究竟是否会损害脑血管的完整性？如果会，其背后的分子机制是什么？这一血管层面的病变，是否与Rett综合征的神经症状存在关联？为了回答这些问题，一项发表在《Molecular Psychiatry》上的研究展开了深入探索。
为了开展研究，研究人员运用了几个关键技术方法：首先，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，将强力霉素诱导表达的ETV2基因盒定点插入到源自Rett综合征患者（携带MeCP2[R306C]或MeCP2[R168X]突变）及其同基因对照的诱导多能干细胞（iPS细胞）的AAVS1安全港位点，从而建立了能够快速、稳定分化为内皮细胞的细胞系。其次，将分化得到的内皮细胞与成纤维细胞一起嵌入纤维蛋白凝胶，置于微流控芯片中，成功构建了仿生的三维微血管网络模型，用以模拟体内的血管结构并评估其功能。最后，综合运用了RNA测序、微小RNA（miRNA）表达谱分析、成像流式细胞术以及钙成像等技术，从转录组、细胞形态和功能等多个层面，系统分析了突变内皮细胞的特性及其对神经元活性的潜在影响。
研究结果
ETV2 expressing iPS cells derived from RTT patients
研究人员首先从携带MeCP2[R306C]突变的Rett综合征患者iPS细胞及其同基因对照细胞出发，通过CRISPR/Cas9技术将强力霉素诱导的ETV2表达盒插入AAVS1位点，建立了稳定的诱导型内皮细胞分化体系。测序证实了突变位点，Western blot显示ETV2可在添加强力霉素后有效诱导表达，且基因编辑后的iPS细胞仍保持多能性。
Differentiation and characterization of iECs
诱导ETV2表达的iPS细胞经过定向分化，成功获得了表达CD31、CD34、VEGFR2等典型内皮标记物的iPS细胞来源内皮细胞。然而，与对照细胞相比，Rett综合征来源的内皮细胞其紧密连接蛋白ZO-1的表达降低且定位异常，ZO-1、OCLDN、CLDN5等紧密连接相关基因的转录水平也显著下调。同时，这些细胞的跨内皮电阻值降低，提示其屏障功能受损。RNA测序分析进一步发现，Rett综合征内皮细胞中与“血管发育调控”和“蛋白质向细胞间连接定位”相关的通路显著下调。
Imaging-enhanced flow cytometry reveals heterogeneity of mutant endothelial cells
通过成像流式细胞术对内皮细胞进行单细胞水平的分析发现，Rett综合征来源的内皮细胞存在明显的细胞周期异常，更多地停滞在S期。基于细胞形态参数的聚类分析显示，高表达ZO-1的细胞簇在对照组中比例更高，而在突变组中比例较低，从单细胞层面印证了突变内皮细胞紧密连接完整性的缺陷。
Impairment of vascular permeability in RTT patient-derived 3D MVNs
为了在更接近生理的三维环境中评估血管功能，研究人员在微流控器件中构建了三维微血管网络。结果显示，虽然突变组和对照组都能形成可灌注的血管网络，但Rett综合征来源的血管网络直径略小，并且对70 kDa葡聚糖的通透性显著高于对照组，表明其血管屏障功能存在缺陷。免疫染色显示三维血管网络中ZO-1的强度也较低。此外，培养基中基质金属蛋白酶MMP8及其抑制剂TIMP1的分泌水平出现异常。
Pathological mechanism associated with endothelial-specific miR-126 dysregulation
为了探究机制，研究人员关注了内皮细胞特异性的微小RNA miR-126-3p。他们发现，在Rett综合征来源的内皮细胞中，miR-126-3p的表达水平显著上调。通过miRNA-mRNA整合分析预测并实验验证，其多个靶基因（如EGFL7、SPRED1、PIK3R2）表达下调。尤为重要的是，分析指出Angiopoietin-1受体（TEK）和内皮素-1（EDN1）这两个对血管稳定和功能至关重要的基因表达下调，且与miR-126-3p的调控相关。
Knockdown of miRNA-126 rescues the phenotype and endothelial barrier functions in RTT-iECs
为了确认miR-126-3p的功能，研究团队在Rett综合征内皮细胞中敲低了miR-126-3p。结果显示，这不仅能部分恢复三维血管网络中ZO-1的表达，还能显著改善血管的通透性。同时，TEK、EDN1以及紧密连接蛋白CLDN5的基因表达水平也得到了恢复。这表明miR-126-3p的上调是导致MeCP2突变内皮细胞血管屏障功能受损的关键介质。
研究结论与意义
本研究的发现首次在人类细胞模型中系统揭示了MeCP2突变通过上调内皮细胞特异性miR-126-3p，进而损害血管完整性的新机制。具体而言，miR-126-3p的异常高表达导致其靶基因TEK（Tie2）和EDN1等下调，扰乱了Ang/Tie2信号通路，最终造成紧密连接蛋白表达减少和血管通透性增加。这一机制在两种不同的MeCP2突变（R306C和R168X）中均得到验证，提示其可能是MeCP2功能缺失相关的普遍表型。
该研究的意义重大。首先，它突破了传统上仅从神经元角度理解Rett综合征的局限，将血管功能障碍确立为疾病病理生理学的一个重要组成部分，为理解患者临床上观察到的循环和灌注问题提供了细胞分子机制的解释。其次，研究建立了首个基于患者iPS细胞的三维Rett综合征血管模型，这套结合CRISPR/Cas9基因编辑、定向分化与微流控器官芯片技术的平台，为在人类背景下研究神经发育疾病的血管病变提供了强大工具。最后，也是最具有转化前景的一点，研究明确指出miR-126-3p是一个潜在的治疗靶点。通过反义寡核苷酸等手段下调miR-126-3p，能够有效逆转血管屏障功能的缺陷。考虑到miR-126在多种血管疾病中的作用，以及已有针对它的抑制剂（如miRisten）进入临床试验，本研究为将血管靶向治疗策略应用于Rett综合征，乃至其他存在血管功能障碍的神经发育性或神经退行性疾病，开辟了新的思路和可能性。
