《The Crop Journal》：Untargeted LC-MS/MS metabolomics reveals farming practice- and cultivar-driven modulations of pea (
Pisum sativum L.) seed metabolome across multiple biosynthetic pathways
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本研究针对豌豆（Pisum sativum L.）种子代谢谱如何受不同农业实践（有机vs常规）和品种类型影响这一关键问题，运用非靶向LC-MS/MS代谢组学对三个丹麦田点种植的十个豌豆品种进行了系统分析。研究成功检测超过1200个代谢物特征，注释了近300个代谢物，发现约40个代谢物与产地效应（独立于品种）相关，100多个代谢物与产地无关的品种效应相关。研究发现有机种植（Hammel点）的豌豆样品中主要豌豆三萜皂苷大豆皂苷I（soyasaponin I）水平较低，而含氮丰富的氨基酸（如哌啶酸、同型瓜氨酸、高精氨酸、天冬酰胺、亚精胺）水平较高，表明土壤氮有效性增加。Akooma和Greenway品种的代谢组最为独特，具有更高水平的多不饱和脂肪酸（PUFA）及其氧化产物，这些物质是已知产生“豆腥味”的物质。常见豌豆品种Ingrid则完全缺乏苯丙烷途径衍生的化合物，包括咖啡酰、阿魏酰和香豆酰天冬氨酸，而其他所有品种均存在。此外，通过GNPS平台中的分子网络和从计算预测的IAA（吲哚-3-乙酸）代谢物注释传播，首次鉴定出三种氯生长素（chloroauxin）代谢物。总体结果表明，豌豆植物的生化适应在其种子代谢组中反映了地理位置或农业实践的影响。这项研究为理解豌豆的营养价值、感官特性（如豆腥味）以及通过代谢组学指导育种和农业生产实践提供了重要见解。
豌豆，这种不起眼的豆科作物，正悄然成为可持续食品系统的明星。随着全球人口增长和气候变化，对可持续食物生产的关注日益增加，同时人们也日益认识到均衡饮食对健康的重要性。在此背景下，豌豆等作物因其固氮能力、高蛋白含量和较低的血糖指数而备受青睐。然而，豌豆的感官品质，特别是令人不悦的“豆腥味”，以及其营养价值，很大程度上取决于其复杂的化学成分——代谢组。这些微小分子不仅关乎植物自身如何适应环境挑战，也深刻影响着最终食品的风味、营养和健康益处。那么，一个核心问题便浮现出来：决定豌豆种子化学图谱的关键因素是什么？是品种自身的基因蓝图，还是它们生长的土壤、气候和农作方式？更具体地说，有机种植的豌豆和常规种植的豌豆，在化学成分上有何不同？不同品种在产生“豆腥味”物质或有益健康的抗氧化成分方面是否存在天然差异？为了回答这些问题，由Sarvar A. Kakhkhorov、S?ren Balling Engelsen、Kristian Holst Laursen和Bekzod Khakimov组成的研究团队展开了一项深入调查。
研究人员采用非靶向代谢组学这一“无偏见”的化学侦察技术，对十个不同豌豆品种在丹麦三个不同田点（其中一处为有机种植，两处为常规种植）生长的种子进行了全面分析。这项研究旨在绘制一张详尽的豌豆种子生化图谱，揭示农业实践和遗传背景如何塑造其代谢命运。研究发现，豌豆种子的化学世界受到产地和品种的双重“雕刻”。有机种植的豌豆显示出独特的“氮富集”特征，其种子中多种含氮丰富的氨基酸水平显著升高，这可能与有机农业中氮的供应形式和土壤微生物活动有关。与此同时，研究还发现两个特定品种（Akooma和Greenway）是潜在的“豆腥味大户”，它们的种子中积累了更高水平的多元不饱和脂肪酸及其氧化产物。而一个在北欧广泛种植的常见品种Ingrid，则意外地缺失了整个苯丙烷代谢途径的一系列关键化合物，包括几种具有潜在健康益处的羟基肉桂酸天冬氨酸结合物。更有趣的是，研究人员如同代谢世界的“侦探”，借助先进的分子网络和计算工具，在豌豆中首次发现了三种新型的氯代生长素代谢物，为理解这类重要植物激素的代谢归宿提供了新线索。这项研究清晰地表明，豌豆种子的代谢组是其适应环境和遗传身份的一面镜子，这些发现将为培育风味更佳、营养更优的豌豆品种，以及优化农业生产实践提供精准的生化依据。相关研究成果发表在《The Crop Journal》上。
为开展此项研究，研究人员运用了几个关键技术方法：首先是非靶向液相色谱-串联质谱（Untargeted LC-MS/MS）代谢组学，这是研究的核心分析技术，用于全面捕获豌豆种子甲醇提取物中的小分子代谢物（分子量 ≤ 1500 Da）。其次是特征提取与注释流程，使用MetaboScape软件进行数据预处理，并综合运用质谱库（实现2级注释）、全球天然产物社会分子网络（GNPS）平台进行特征分子网络分析，以及SIRIUS平台（含CSI: FingerID和CANOPUS工具）进行分子式和结构预测（实现3级注释）。再次是统计与可视化分析，采用方差分析-同时成分分析（ANOVA-simultaneous component analysis, ASCA）来分解实验设计（产地、品种及其交互作用）引起的代谢组数据变异，并使用经错误发现率（FDR）校正的单因素方差分析（one-way ANOVA）筛选受单一因素显著影响的代谢物。样本队列来源于2022年在丹麦三个地理位置（Sejet, Gamborg, Hammel）田间试验种植的十个豌豆品种，每个地点每个品种三个生物学重复，共计90个样品，其中Hammel点采用有机农业实践，其余两点为常规种植。
3.1. 豌豆代谢组
通过对90个样品进行LC-MS/MS数据处理，最终得到包含1230个代谢物特征的表。利用MetaboScape中的质谱库鉴定出121个2级置信度的代谢物，通过GNPS平台的特征分子网络注释了173个特征，利用SIRIUS平台的CSI: FingerID工具以≥0.4的COSMIC置信度注释了178个代谢物。CANOPUS工具预测了424个代谢物的分子类别，主要包括脂肪酸衍生物、氨基酸/肽类、甘油（磷）脂、生物碱、萜类、苯丙素等。这为后续分析奠定了数据基础。
3.2. 基于ASCA的研究设计变异分解
ASCA分析表明，对于121个2级注释代谢物，品种效应解释了最大的变异（28.6%），其次是品种与产地的交互效应（17.2%），产地效应解释了7.8%的变异，且三者均具有统计学显著性。
3.3. 产地效应
产地效应引起的变异主要源自有机种植点Hammel的样品与两个常规点（Gamborg和Sejet）样品之间的差异。ASCA载荷图显示，区分Hammel样品的代谢物特征包括升高的多种氨基酸（哌啶酸、组氨酸、天冬酰胺、高精氨酸、同型瓜氨酸）和某些脂类化合物。Gamborg样品以较高的腺苷一磷酸（AMP）、2-脱氧腺苷水平为特征，而Sejet样品则富含N-苯乙酰天冬氨酸、胆碱等。单因素方差分析进一步鉴定出33个2级注释代谢物和41个3级（SIRIUS注释）代谢物受产地显著影响。例如，哌啶酸在Hammel样品中丰度最高（效应大小47.8%），而同型瓜氨酸、高精氨酸、亚精胺等也呈现类似趋势。N-苯乙酰天冬氨酸则在Sejet样品中最丰富。在3级注释代谢物中，精氨琥珀酸和豌豆植保素（phytolakin）豌豆素（pisatin）在Hammel样品中含量较高，而大豆皂苷I在Hammel样品中含量反而最低。
3.4. 品种效应
品种效应对代谢组变异的影响最为突出。ASCA分析显示，Akooma和Greenway两个品种的代谢组与其他八个品种明显分离，其主要特征是含有更高水平的脂肪酸及其衍生物，特别是多不饱和脂肪酸（PUFA）的氧化产物，如9-氧代-十八碳二烯酸、9-羟基-十八碳三烯酸等，这些物质与“豆腥味”有关。单因素方差分析在121个2级注释代谢物中鉴定出74个受品种显著影响的代谢物。其中，色原酮（chromone）在Ingrid品种中几乎缺失（效应大小92.5%）。Ingrid品种也缺乏原儿茶酸。Akooma和Greenway品种中多种PUFA衍生氧化脂质（oxylipins）水平最高。在天冬酰胺、天冬氨酸、同型瓜氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸等氨基酸水平上，不同品种间也存在显著差异。在178个3级注释代谢物中，105个受品种显著影响。咖啡酰天冬氨酸、阿魏酰天冬氨酸和香豆酰天冬氨酸在Ingrid品种中完全缺失，而在Orchestra和Karacter品种中最丰富。大豆皂苷I在不同品种间含量也有差异，在Greenway品种中最高。
3.5. 利用质谱计算工具对豌豆种子中新型吲哚代谢物和三萜皂苷的初步鉴定
结合GNPS中的分子网络和SIRIUS的计算方法，研究人员鉴定出更多受产地和品种影响的代谢物，并进行了新颖的注释。其中一个被SIRIUS注释为1-N-β-吡喃葡萄糖基-2-氧代吲哚-3-乙酰-N-天冬氨酸（oxIAA-Asp-N-Glc）的代谢物显示出显著的品种依赖性变异。通过分子网络扩展该注释，发现了三个新型氯代生长素（chloroauxin）代谢物，通过分析其串联质谱（MS/MS）图谱中的诊断性碎片离子和特征性的氯同位素模式，将其初步注释为4-氯-1-N-β-吡喃葡萄糖基-2-氧代吲哚-3-乙酰-N-天冬氨酸（4-Cl-oxIAA-Asp-N-Glc）及其羟化和进一步糖基化的衍生物。据研究者所知，这些氯代氧吲哚-3-乙酸衍生物此前未见报道。类似地，对三萜皂苷也进行了深入的网络分析和注释验证，例如初步鉴定了一个糖基化的大豆皂苷βg（soyasaponin βg）类似物。
这项研究通过非靶向代谢组学深度剖析了豌豆种子的生化景观，揭示了农业实践和品种遗传背景对其代谢组的深刻影响，并得出了一系列重要结论。首先，研究发现有机种植（Hammel点）的豌豆种子中，多种氮富集氨基酸（如哌啶酸、同型瓜氨酸、天冬酰胺、高精氨酸、亚精胺）和精氨琥珀酸水平显著升高。这很可能反映了有机农业系统中氮供应（依赖微生物矿化和生物固氮）与常规农业（施用易吸收的无机氮肥）的根本差异。植物在有机条件下可能面临不同的氮同化压力和胁迫，从而积累了这些作为氮储存、运输或胁迫响应信号的化合物。其次，研究明确了品种是决定豌豆种子代谢谱的首要因素。Akooma和Greenway品种因其高含量的多不饱和脂肪酸（PUFA）及其脂质氧化产物（氧化脂质）而脱颖而出，这些物质是已知的“豆腥味”前体物，这提示在育种中需关注这些品种的感官品质。尤为值得注意的是，广泛种植的Ingrid品种完全缺失了苯丙烷途径产生的一系列羟基肉桂酸天冬氨酸结合物（如咖啡酰、阿魏酰、香豆酰天冬氨酸）以及色原酮、原儿茶酸等，这可能源于育种过程中对该途径的无意或有意选择，虽可能影响风味复杂性和抗氧化潜力，但也为培育低苦涩味品种提供了天然模板。再者，研究人员利用先进的计算质谱学工具，成功在豌豆中初步鉴定出三种新型的氯代生长素代谢物（4-Cl-oxIAA-Asp-N-Glc及其衍生物）。这一发现不仅扩展了对豌豆特有植物激素4-氯吲哚-3-乙酸（4-Cl-IAA）代谢归宿的认识，也展示了分子网络与计算注释相结合的策略在发现新型植物代谢物方面的强大能力。最后，研究还系统表征了豌豆中三萜皂苷的组成，发现大豆皂苷βg是主要皂苷，并探讨了不同皂苷与感官苦味的关系。
综上所述，这项研究有力地证明了豌豆种子的代谢组是其基因型与生长环境（特别是农作方式）互作的动态产物。研究不仅定位了与“豆腥味”、氮代谢、防御化合物生物合成相关的关键代谢途径和品种特异性差异，还发现了全新的代谢物家族。这些发现具有多重重要意义：在基础研究层面，深化了我们对豆科作物环境适应和代谢多样性的理解；在农业与育种应用层面，为通过代谢标记辅助筛选，培育兼具优良农艺性状、更佳风味（低豆腥味）和更高营养价值的豌豆新品种提供了精准的生化靶点和理论依据；在食品科学层面，有助于优化豌豆的加工工艺，以调控或消除不良风味物质，提升豌豆蛋白等产品的可接受度。尽管研究存在有机种植点单一的局限性，但其揭示的代谢组学图谱和建立的综合分析框架，无疑将为推动豌豆作为一种可持续、营养、美味的未来食物资源奠定坚实的科学基础。
