《Current Opinion in Cell Biology》：Chemical biology approaches for revealing interorganelle lipid transport pathways
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这篇综述系统总结了化学生物学领域用于揭示细胞器间脂质运输通路的最新工具。文章聚焦于通过特异性化学探针和工程蛋白策略，实现对不同细胞器膜上脂质的高时空分辨率可视化、定量与操纵，从而解析维持脂质稳态的酶与转运蛋白，为理解脂质代谢相关疾病机制提供新视角。
细胞膜是充满脂质的动态结构，它们包裹着细胞及其内部的各种细胞器。理解脂质在紧密堆积的膜环境中如何被代谢、组织和交换，需要能够绘制细胞器特异性脂质网络及其相关蛋白质机器的强大策略。来自化学生物学领域的最新进展，提供了一系列功能强大且精确的工具，可在细胞器水平上探测脂质，实现脂质库的高时空分辨率可视化、定量和操纵。这些方法包括定制的小分子化学探针以及精心设计的工程蛋白工具。这些化学策略共同扩展了我们解析脂质动力学的能力，并为理解基础的细胞脂质稳态及相关疾病机制提供了新见解。
化学探针用于细胞器特异性脂质标记与脂质动力学追踪
识别单个脂质的亚细胞分布并揭示其被运送到不同细胞器的途径，是膜生物学中重要的知识空白。迄今为止，一系列化学工具已经出现以填补这些空白。这些方法可大致分为三类：(i) 基于重氮嗪的光交联探针；(ii) 可点击脂质前体的代谢掺入；(iii) 用于标记天然脂质的光催化剂策略。
Nadler及其同事最近报告了一种使用经过最小修饰的双功能光亲和探针来追踪不同脂质物种的策略。这些合成的脂质探针在酰基尾部带有一个小的重氮嗪基团用于光交联，末端带有炔基用于通过点击化学进行荧光标记。结合高分辨率荧光成像、AI辅助分割和傅里叶变换质谱分析，作者克服了这些障碍，并量化了整个细胞器网络中的脂质交换和代谢。动力学分析表明，由脂质转运蛋白介导的非囊泡脂质运输是所检查的大多数细胞器间脂质通量的原因，该运输主要是逆向的，并且比囊泡脂质运输具有更高的脂质特异性。此外，基因扰动实验表明，LTP和ATP驱动的脂质转位共同作用，指导脂质运输以维持细胞器膜的组成和不对称性。这项研究为追踪脂质物种建立了一个定量框架，并为脂质动力学的机理研究构建了一个可推广的平台。
H?glinger课题组开发了三功能脂质探针，与上述双功能探针相比，它们加入了一个光笼化的香豆素基团以实现溶酶体靶向。这些探针能够在溶酶体内实现细胞器特异性递送和光触发释放鞘氨醇和胆固醇。通过这种方法，作者证明了胆固醇转运蛋白也参与了鞘氨醇从溶酶体中的输出。
磷脂酰胆碱(PC)在细胞膜中含量丰富，因此，使用炔基或叠氮修饰的胆碱前体进行代谢标记通常缺乏细胞器特异性。然而，通过将这些脂质与细胞器靶向染料通过应变促进的炔-叠氮环加成生物正交反应偶联，可以实现选择性的细胞器可视化，从而在质膜、内质网和线粒体处进行检测。Hamachi、Tamura和同事用这种方法为自噬体膜源自内质网膜提供了直接证据。除了PC，该策略也适用于叠氮修饰的脂肪酸，以实现对跨不同亚细胞库的脂肪酸检测。
本课题组开发的另一种方法同样依赖于PC的代谢标记，其细胞器选择性是通过一系列胆碱类似物的结构特征而非用于生物正交化学检测步骤的细胞器导向染料来实现的。我们利用了通用有机阳离子转运蛋白(OCT1)的过表达来促进这些合成的带电胆碱类似物的摄取。通过磷脂酶D介导的转磷脂酰化反应，这些探针被掺入PC类似物中，经过细胞器间运输后，分布到不同的亚细胞位置。这种方法通过在特定膜上提供一个可点击的柄，还可用于锚定生物活性分子以调节细胞信号通路。
光驱动光催化的日益广泛应用极大地推进了邻近标记蛋白质组学，与广泛使用的基于蛋白质的工具相比，提供了改进的时空分辨率。这些方法涉及将小分子有机金属光催化剂或有机光敏剂连接到感兴趣的蛋白质上，从而催化激活附近的具有光反应活性的探针，用于相互作用组分析。此外，有机染料衍生的光催化剂因其优异的细胞渗透性和亚细胞定位，为基于金属的系统提供了一个有前景的替代方案。尽管光催化邻近标记近年来被广泛应用于蛋白质相互作用组作图，但其用于追踪其他生物分子的应用仍然有限。通过调整邻近标记用于脂质分析，Zhu及其同事使用定位光催化染料研究了细胞中细胞器特异性的脂质组成和运输。作者开发了一种用于脂质标记的光活化苯基叠氮探针，使用有机染料作为光催化剂。该探针包含一个疏水性接头以增加其亲脂性和膜结合力，以及一个电离增强子以提高质谱检测。在蓝光照射下，苯基叠氮产生反应性三重态氮宾，最终与丰富的PE和PS脂质的亲核脂质头部基团发生共价修饰。通过将具有不同细胞器亲和力的染料基光催化剂结合，作者实现了在线粒体、细胞核和溶酶体中的细胞器特异性脂质标记。
总之，这些方法各有优缺点。例如，基于天然脂质衍生化的标记策略（如双和三功能重氮嗪脂质）在追踪单个脂质物种方面很强大，但它们通常容易受到快速代谢重塑或内源酶降解的影响。因此，长时间标记通常会导致脂质身份丢失，使下游分析复杂化。这些脂质探针的疏水性也使其难以递送进入细胞。为了应对这一限制，可使用水溶性更好的脂质前体，不过这些探针通常需要更长的标记时间以确保充分的膜掺入。基于光催化剂的标记规避了探针代谢问题，但这些方法目前主要依赖于质谱读数，缺乏解析动态细胞器间脂质运输的空间分辨率。这些局限性凸显了该领域对整合了代谢稳定性、高效递送和细胞器间脂质运输空间分辨测量的细胞内化学工具的迫切需求。
工程蛋白策略分析细胞器脂质分布与通量
除了小分子和脂质类似物，工程蛋白也成为探究细胞器脂质生物学的有力工具。Budin及其同事开发了一种称为荧光原激活共现传感(FACES)的策略，该策略整合了叠氮胆碱代谢物、可点击荧光原和细胞器靶向的荧光原激活蛋白(FAPs)。这种方法利用了每个组件的优势，在特定膜内实现对脂质库的高度选择性可视化。在FACES设置中，基因编码的非荧光FAP通过融合细胞器靶向序列被锚定在目标细胞器膜小叶上。随后，细胞被提供叠氮胆碱类似物，该类似物通过肯尼迪途径和随后的细胞器间脂质运输，代谢掺入几乎所有细胞膜中的PC。然后通过生物正交SPAAC标记将非荧光小分子探针（荧光原）连接到叠氮PC物种上，只有当荧光原标记的脂质与细胞器限制性的FAP结合时，荧光才会被触发。作者进一步证明，FACES不仅限于对PC的细胞器库进行成像，还可应用于非脂质代谢物，如在线粒体内膜上观察到的O-GlcNAc修饰的糖蛋白。这些发现凸显了FACES作为一种检测低丰度生物分子的非常灵敏的方法。
为解决监测细胞器间脂质运输的问题，Kornmann及其同事开发了一种称为质量标记细胞脂质追踪(METALIC)的酶促标记方法，该方法通过一对酶在运输的脂质上安装不同的质量标签来监测细胞器间的脂质交换。在这个双酶系统中，内质网定位的PE甲基转移酶(PEMT)在将PE转化为PC的过程中，用同位素标记的甲基基团标记乙醇胺头部基团，而外源表达的细菌环丙烷脂肪酰基磷脂合酶(CFAse)在不饱和酰基尾部安装一个独特的同位素标记的环丙烷基团。通过将这些酶定位在选定的细胞器上，并利用含有氘的甲硫氨酸进行稳定同位素代谢标记，METALIC能够通过细胞内质量标记和体外基于质谱的脂质组学分析，监测酵母和哺乳动物细胞中的细胞器间脂质运输。
新兴脂质追踪方法揭示脂质稳态维持机制的新视角
我们最近引入了一种“喂养与垂钓”策略，以识别在细胞器水平上调节PA稳态的蛋白质。在这种方法中，一种蓝光控制的超活性磷脂酶D（superPLD）——称为光遗传学膜编辑器——用于在目标膜上“喂养”PA，而一种膜锚定的TurboID则“垂钓”附近的蛋白质。同时使用这对工程蛋白模块，可以在同一细胞器实现受控的PA升高和相关蛋白质组变化的检测，从而揭示在富含PA与缺乏PA的细胞器膜上被募集或排斥的蛋白质，作为PA代谢稳态的潜在调节因子。我们发现，几种PA代谢酶和LTP共同作用，以降低质膜和溶酶体膜胞质小叶局部升高的PA水平。值得注意的是，除了已知的PA转运蛋白Nir2，我们还发现另一种LTP——固醇载体蛋白2(SCP2)，在体外和细胞内也能促进PA的转运。总的来说，这种方法能够系统地识别PA调节因子，并为了解控制PA稳态和细胞器间运输的途径提供了见解。
除了使用“喂养-垂钓”策略系统地识别PA调节因子外，我们还利用生物正交探针，通过将PLD催化的转磷脂酰化与快速的应变促进生物正交点击反应相结合，来表征某些介导磷脂从质膜到内质网运输的LTP。通过基因扰动，我们证明了来自扩展突触结合蛋白家族的LTP能够运输PLD生成的荧光磷脂，这表明这些生物正交脂质探针可以作为细胞中扩展突触结合蛋白脂质转运活性的报告分子。
结论与展望
化学生物学工具改变了我们可视化、操纵和量化细胞器间脂质运动的能力。在这篇综述中，我们重点介绍了这些工具的最新进展，强调了它们在绘制细胞器脂质分布与动力学、揭示运输途径以及识别维持膜组成的蛋白质方面的影响。然而，这些方法并非没有局限。一个关键问题是，考虑到即使对脂质物理化学性质进行微小的化学修饰也会产生影响，那么带有可点击柄、光交联剂或荧光团的合成探针是否能准确再现内源脂质的行为。此外，许多脂质物种缺乏合适的代谢标记前体，这限制了诸如FACES等方法在可视化特定类型脂质运输中的应用。细胞器特异性染料标记和细胞器靶向光催化标记等方法提供了选择性，但其适用性可能局限于某些细胞器。未来在细胞器特异性脂质标记方面的努力，将受益于将这些方法应用到更多的细胞器，以及设计能更紧密地模拟天然脂质行为的、更接近天然状态的探针。
