《Nature Chemical Biology》：High-throughput ligand diversification to discover chemical inducers of proximity
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尽管分子胶降解剂日益重要，但其发现仍主要依赖偶然。本研究描述了一种高通量方法，可将现有配体系统地改造为分子胶降解剂。研究人员利用硫氟交换化学，在ENL和BRD4配体上安装了3163个多样化结构模块，通过表型筛选发现了能够分别募集CRL4CRBN和SCFFBXO3的新型分子胶降解剂dHTC1和dHTC3。这项工作将高通量化学与功能筛选相结合，为前瞻性发现化学诱导邻近分子和新的效应因子提供了一种简便工具。
在药物研发的前沿阵地，有一类特殊的“粘合剂”分子，它们能将两个本不直接相互作用的生物大分子拉到一起，引发一系列细胞生物学反应的重新布线，这类分子被称为化学诱导邻近分子。其中，像沙利度胺及其类似物那样，能诱导E3泛素连接酶底物受体Cereblon（CRBN）降解“不可成药”靶点的“分子胶”，展现出了巨大的治疗潜力。然而，与可以通过理性设计获得的异双功能降解剂（如PROTACs）不同，分子胶的发现历程充满了意外和回顾性。大多数分子胶都是在研究已知化合物作用机制时被偶然发现的，缺乏模块化的前瞻性设计原则。这导致了一个核心困境：我们能否像“搭积木”一样，通过系统性的化学修饰，将已知的靶点配体主动转化为能够募集特定E3连接酶的分子胶降解剂？
为了解决这一挑战，并探索结构修饰在多大程度上能够赋予配体分子胶活性，一个研究团队在《Nature Chemical Biology》上发表了一项开创性工作。他们开发了一种将高通量配体多样化与靶向蛋白降解表型筛选相结合的策略，成功地以前瞻性方式发现了能将现有配体转化为化学诱导邻近分子的结构修饰。这项研究不仅为发现新化学诱导邻近分子提供了强大工具，也揭示了分子胶与E3连接酶相互作用的复杂性和特异性。
研究人员主要运用了以下几项关键技术：基于硫氟交换的高通量化学，用于在核心配体骨架上快速、平行地安装数千种结构多样的模块；基于HiBiT发光肽融合蛋白的活细胞靶蛋白稳定性报告系统，用于高通量筛选降解活性；基于CRISPR-Cas9的遗传筛选（包括聚焦泛素-蛋白酶体系统的sgRNA库筛选和深度突变扫描），用于鉴定降解过程必需的效应因子和耐药突变位点；以及包括表面等离子共振、荧光偏振、时间分辨荧光共振能量转移在内的多种生物物理技术，用于定量分析分子、蛋白质之间的相互作用和三元复合物形成。此外，研究还运用了冷冻电镜和X射线晶体学解析了关键的三元复合物和二元复合物高分辨率结构，并通过定量蛋白质组学和RNA测序评估了降解剂的 selectivity 和下游生物学效应。
结果
高通量多样化将配体转化为降解剂
为了验证概念，研究人员选择了一个已知的结合ENL（eleven-nineteen leukemia）蛋白YEATS结构域但不影响其稳定性的配体SR-0813。他们首先合成了其简化类似物TM-7，并通过硫氟交换化学为其安装了一个亚氨基硫氧二氟SuFEx反应柄。利用这个反应柄，他们与一个包含3163个结构多样的胺类构建块的库进行平行反应，合成了超过3000个TM-7类似物。随后，他们直接在表达HiBiT-ENL融合蛋白的MV4;11急性髓系白血病细胞中，对这些粗产物进行了ENL降解活性筛选。从初筛的93个苗头化合物中，他们发现并验证了一个活性分子，将其纯化后命名为rac-dHTC1。该化合物能够在多种AML细胞系中诱导ENL的剂量和时间依赖性降解，且降解过程可被ENL配体SR-0813、neddylation抑制剂MLN4924和蛋白酶体抑制剂卡非佐米所阻断，表明其通过Cullin-RING连接酶和蛋白酶体途径降解ENL。定量蛋白质组学分析证实dHTC1能选择性降解ENL及其同源蛋白AF9，并下调ENL转录靶基因的表达。
ENL被dHTC1降解通过CRL4CRBN进行
通过基于CRISPR的遗传筛选，研究人员发现CRBN是dHTC1介导ENL降解所必需的效应因子。在CRBN敲除细胞中，dHTC1的活性完全丧失，而过表达CRBN则能增强其降解效能。与传统的CRBN降解剂（如PROTAC SR-1114）不同，dHTC1本身对CRBN的亲和力极弱，在细胞和体外实验中均无法有效竞争性结合CRBN。然而，当dHTC1预先与ENL形成复合物后，其对CRBN的亲和力显著增强，表现出高达220倍的协同结合效应。这表明dHTC1的作用机制依赖于其与ENL结合后，形成的“蛋白质-配体”复合表面再协同性地招募CRBN。
dHTC1与CRBN的结合依赖于初始的ENL结合
结构活性关系研究进一步支持了这一机制。将dHTC1中的磺酰胺连接键替换为酰胺或脲键，得到的类似物虽能结合ENL，却完全丧失了降解活性和协同招募CRBN的能力。此外，研究人员分离了dHTC1的两个对映异构体，发现只有(S)-构型具有降解活性，而(R)-构型虽能以相同亲和力结合ENL，却无法有效介导三元复合物形成和降解。这些结果表明，dHTC1的活性高度依赖于其与ENL结合后诱导产生的、具有立体化学选择性的协同界面。
广泛接触稳定了dHTC1结合的ENL在CRBN上
为了在原子层面理解这一协同招募机制，研究人员通过冷冻电镜解析了DDB1•CRBN•(S)-dHTC1•ENL YEATS三元复合物的结构，分辨率达2.9 ?。结构显示，(S)-dHTC1的螺环琥珀酰亚胺部分结合在CRBN的IMiD口袋中，而其氨基咪唑并吡啶核心则插入ENL的乙酰化赖氨酸结合通道。更重要的是，结构揭示了ENL与CRBN之间存在着广泛的蛋白质-蛋白质相互作用界面，埋藏溶剂可及表面积约2258 ?2，形状互补性高。CRBN的N端结构域发生了明显的构象变化以适应与ENL的结合。点突变实验证实，破坏这些界面相互作用的ENL突变体（如R16A, E74A, K72A）能显著削弱或完全阻断dHTC1介导的降解，但对PROTAC SR-1114的影响较小，凸显了这些蛋白质-蛋白质接触对于dHTC1作为分子胶功能的关键性。
HTC产生具有良好生物学特性的分子胶
与基于沙利度胺的ENL PROTAC SR-1114相比，dHTC1表现出更优越的理化性质和药理特性。在细胞增殖实验中，(S)-dHTC1能强效、立体选择性地抑制ENL依赖的MV4;11细胞生长，且活性在CRBN敲除细胞中丧失。在小鼠药代动力学实验中，(S)-dHTC1表现出良好的暴露量。在MV4;11异种移植白血病模型中，给药(S)-dHTC1能在小鼠骨髓中有效降解ENL，并特异性地下调ENL靶基因，同时诱导白血病细胞向髓系分化（CD11b表达上调），证明了其体内药效。
基于HTC将BRD4配体转化为降解剂
为了验证该策略的普适性，研究人员将同一高通量方法应用于另一个靶点——BET蛋白BRD4的配体JQ1。他们合成了JQ1的SuFEx前体，并用相同的胺库合成了超过3000个类似物，筛选能够降解BRD4的分子。从中发现了两个活性化合物dHTC2和dHTC3。定量蛋白质组学证实二者能选择性降解BRD4。
F-box蛋白3介导dHTC3对BRD4的降解
通过全基因组和聚焦UPS的CRISPR筛选，研究人员发现dHTC2和dHTC3通过不同的E3连接酶发挥作用。dHTC2依赖于CRL4DCAF16，而dHTC3则意外地招募了一个此前未被用于化学重编程的E3连接酶——SCFFBXO3。FBXO3敲除完全阻断了dHTC3的活性。进一步研究表明，dHTC3是一个BD1特异性的BRD4降解剂。它只能通过BRD4的第一个溴结构域（BD1）介导与FBXO3的三元复合物形成和后续降解，即使其本身能够结合BD2。这种特异性由分子胶、靶蛋白和E3连接酶之间形成的独特三元复合物界面所决定。
结论与意义
本研究成功地建立并验证了一种将高通量化学与功能表型筛选相结合的前瞻性发现化学诱导邻近分子的平台。通过该平台，研究人员从一个已知的ENL配体出发，发现了一个新型的分子胶降解剂dHTC1。dHTC1通过一种独特的“协同招募”机制发挥作用：它首先与靶蛋白ENL结合，形成的复合物表面再以高亲和力、高特异性招募E3连接酶CRBN，这一过程依赖于ENL与CRBN之间广泛的蛋白质-蛋白质相互作用。同样地，从BRD4配体JQ1出发，他们发现了能募集非经典E3连接酶FBXO3的BD1特异性分子胶dHTC3。这些发现挑战了对于分子胶必须独立高亲和力结合E3连接酶的传统认知，揭示了通过弱初始结合和协同界面实现高效降解的新范式。
这项工作具有多重重要意义。首先，在方法论上，它提供了一种系统性、可扩展的“配体到分子胶”转化策略，有望改变分子胶发现依赖运气的现状。其次，在机制认知上，它阐明了分子胶可通过诱导产生扩展的蛋白质-蛋白质相互作用界面来实现对E3连接酶的高度协同性招募，这为理性设计分子胶提供了新的思路和结构基础。最后，在转化应用上，研究获得的dHTC1和dHTC3不仅作为有用的化学探针，其展现出的良好类药性质（如体内稳定性、选择性）也提示，通过此类策略发现的分子胶可能具有优于传统PROTACs的开发潜力。总之，这项研究将高通量化学引入了邻近药理学的工具箱，为探索新的治疗模式和理解蛋白质相互作用的化学调控开辟了新道路。
