《Developmental & Comparative Immunology》：An Improved Comprehensive Method for Collecting Single Nuclei from Shrimp Ovaries
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单细胞测序技术优化用于凡纳滨对虾卵巢组织单核分离，通过调整裂解方法（0.1% NP40手动研磨5分钟）、离心策略（高低速离心结合碘ixanol固定）及质量控制（HE染色、电镜观察），显著提升核回收率至40.56%，减少细胞团块和碎片，为 crustacean 深层组织单细胞研究提供标准化方案。
颜梅桐|欧阳慧敏|刘青云|胡晓东|黄玉柳|杨春玲|彭敏|陈天聪|张斌|陈秀丽|胡廷军|王帆|赵永珍
广西大学动物科学技术学院，中国南宁530005
摘要
单核测序是研究卵巢发育的强大工具。然而，目前尚缺乏针对甲壳类动物的标准化单核分离方案。在本研究中，首次系统优化了Litopenaeus vannamei核悬浮液的制备关键参数，采用了HE染色、台盼蓝染色、扫描电子显微镜观察、10× Genomics质量控制数据以及t-SNE图谱等评估方法。结果表明，新鲜卵巢组织的最佳裂解效率是通过使用0.1% NP40手动研磨5分钟实现的，同时该方法保证了核的质量。此外，还采用了碘辛醇辅助法来减少离心过程中对核的机械损伤，显著提高了核的回收率。为了捕获尽可能多的核类型，我们结合了高速和低速离心，提高了核的回收率并减少了数据偏差。虾卵巢样本的处理时间可在40分钟或更短时间内完成。通过优化方法从虾卵巢中分离出的单核细胞形状均匀、边界清晰，团块和杂质显著减少，上清液中的核残留物极少。核的回收率从4.78%提高到了40.56%。本研究填补了L. vannamei生殖系统单细胞研究的空白，为甲壳类动物复杂组织样本中核悬浮液的制备提供了新的方向和见解。
引言
Litopenaeus vannamei（罗非虾）是全球水产养殖业中最重要的经济物种之一，因其生长迅速和较强的环境适应性而受到广泛关注（Wu等人，2022年；Yuan等人，2023年）。卵巢是L. vannamei生殖研究的关键器官，其结构复杂，包含生殖细胞和体细胞，如卵母细胞、颗粒细胞、基质细胞、血管平滑肌细胞、卵泡细胞和免疫细胞（Phinyo等人，2018年；Tinikul等人，2011年）。探索L. vannamei卵巢在不同发育阶段的分子变化和细胞相互作用对于优化养殖策略和推动虾产业发展至关重要。
近年来，单细胞技术，特别是单核RNA测序（snRNA-seq）发展迅速，成为研究复杂组织中细胞异质性的强大工具（Luo等人，2024年；Zhang等人，2023年）。该技术特别适用于处理细胞直径较大且形态不规则的样本（Santo等人，2024年；Zeng等人，2016年）。McGlacken-Byrne等人（2025年）利用snRNA-seq鉴定人类卵巢细胞中的基因表达特征并分析神经内分泌信号传导。Petrany等人（2020年）使用snRNA-seq研究了小鼠不同发育阶段多核肌纤维中的转录异质性，揭示了肌核在发育中的关键作用。除了哺乳动物，snRNA-seq还应用于其他物种的复杂组织，包括鸡的神经内分泌网络（Leng等人，2024年）、大西洋鲑鱼的头部肾脏组织（Andresen等人，2024年）、果蝇的神经组织（McLaughlin等人，2021年）以及螃蟹的卵巢组织（Lu等人，2025年）。然而，与哺乳动物相比，包括甲壳类动物在内的低等生物的单细胞研究仍处于早期阶段。现有的关于虾的单细胞研究主要集中在免疫细胞上，例如血细胞亚型的分化及其在病理过程中的免疫反应（Cui等人，2022年、2024年；Liang等人，2023年；Zhu等人，2022年），而对生殖系统的研究仍然有限。因此，利用snRNA-seq技术构建L. vannamei卵巢的细胞图谱具有重要意义。
制备核悬浮液是snRNA-seq的关键步骤。研究表明，核的回收率、完整性和多样性直接影响下游测序的可靠性和数据质量（Garcia-Flores等人，2023年）。已经建立了针对哺乳动物细胞的成熟核悬浮液制备方案（Jiao等人，2026年；Ma等人，2025年；Slyper等人，2020年；Waag和Bohacek，2023年）。然而，不同物种间组织结构和生化性质的显著差异可能限制了该方法的适用性。Yao等人（2024年）在罗非鱼卵巢研究中使用含有1.0% BSA的PBS缓冲液，并以500 ×g离心5分钟来收集核。Wang等人（2024年）在牡蛎研究中使用含0.01% BSA的PBS缓冲液来保护卵巢中的核。McLaughlin等人（2022年）通过手动研磨并以1000 ×g离心10分钟从果蝇卵巢中获得了高质量的核样本。这些研究表明，不同物种制备核悬浮液的最佳条件各不相同，我们必须根据L. vannamei卵巢组织的特点制定针对性的策略。
本研究旨在优化多个参数，包括样本预处理、裂解缓冲液浓度、裂解方法、处理时间和离心条件，以建立有效的L. vannamei卵巢核悬浮液制备方案。我们的研究填补了L. vannamei生殖系统snRNA-seq研究的空白，为探索虾卵发生和发育的单细胞机制奠定了基础。
实验部分
动物
本研究使用的所有健康雌性L. vannamei（90天大）均来自中国南宁广西渔业科学院的L. vannamei遗传育种中心。
仪器和试剂
仪器和试剂的来源分别列于表1和表2中。本研究中使用的工作溶液按照表3、表4和表5中的配方制备。所有制备好的试剂均在4°C下保存直至使用。卵巢组织解剖
随机选取三只虾，并将其标记为样本1。
虾卵巢组织的组织学观察
三个虾样本的平均体重为21.0克±0.83克，GSI为0.182%±0.015%（图1C）。解剖后，卵巢呈半透明状，无粘连现象（图1B）。HE染色（图1D）显示卵巢核的直径范围为2.1微米至24.3微米，均小于40微米，符合10× Genomics平台的要求。
核悬浮液制备的优化
核悬浮液的制备遵循图2A所示的技术流程。
讨论
本研究使用10× Genomics Chromium系统对L. vannamei卵巢组织进行snRNA-seq分析。由于液滴尺寸的限制，系统要求输入样本的直径小于40微米（Denisenko等人，2020年）。通过HE组织切片染色发现，虾卵巢样本的核直径范围为2.1微米至24.3微米，符合系统要求，证明该系统适用于L. vannamei卵巢的snRNA-seq分析。
结论与展望
总之，本研究首次系统优化了L. vannamei卵巢核悬浮液的制备方法，并创新性地提出了新的甲壳类动物研究方法，包括使用新鲜样本、碘辛醇分层以及结合高速和低速离心。通过优化方法从虾卵巢中分离出的单核细胞形状均匀、边界清晰，团块和杂质显著减少，上清液中的核残留物极少。
作者贡献声明
陈天聪：研究工作。
张斌：监督、资源协调、概念设计。
陈秀丽：资金筹集、数据管理。
胡廷军：验证、方法学研究。
胡晓东：方法学研究、数据收集。
黄玉柳：项目管理、数据收集。
杨春玲：验证、资源协调。
彭敏：写作、审稿与编辑、数据分析。
欧阳慧敏：数据可视化、验证、数据分析。
赵永珍：写作、审稿与编辑、项目管理、资金协调
未引用文献
Sandoval等人，2023年；Schm?kel等人，2023年；Sharifian和Norouzi，2023年。
数据可用性声明
部分或所有研究过程中生成或使用的数据、模型或代码可向相应作者索取。
利益冲突声明
本研究不存在任何利益冲突。
致谢
本工作得到了“广西科技创新计划‘新型高产抗病罗非虾品种培育’项目”（项目编号：GK AA23062046）以及国家自然科学基金“Blimp1调控虾巨噬细胞样细胞免疫活性的机制研究”（项目编号：32373169）、国家虾产业技术体系建设项目（CARS-48-02）和广西农业科技自筹项目的财政支持。
