结构类似物TOCP和TPHP通过干扰能量代谢的不同机制，在斑马鱼中诱发免疫毒性

本研究以斑马鱼幼虫为模型，探究两种类似结构的有机磷阻燃剂TOCP和TPHP的免疫毒性差异。通过转录组和代谢组学分析发现，两者通过调控糖酵解和嘌呤代谢等能量相关通路，导致不同的免疫应答：TOCP促进炎症，TPHP抑制炎症，但均削弱抗菌能力。分子动力学模拟显示AMPK与TOCP结合更稳定，可能介导其毒性机制。

　　

李新燕|赖东梅|姚瑶|邓洁薇|罗丽娟|梁小平|栾天刚

广东工业大学生物医学与药学科学学院，中国广州510006

摘要

芳基有机磷阻燃剂（aryl-OPFRs），如三苯基磷酸酯（TPHP）和三（2-甲基苯基）磷酸酯（TOCP），已被确认为普遍存在的环境污染物，但它们在水生生物中的免疫毒性及其潜在机制仍不清楚。本研究利用斑马鱼幼体，在适应性免疫系统成熟之前的先天免疫窗口期，探讨了两种结构相似的aryl-OPFRs的免疫调节作用。值得注意的是，它们诱导了相反的免疫反应：TOCP增加了巨噬细胞的数量并引发了炎症，而TPHP则减少了中性粒细胞和巨噬细胞的数量并抑制了炎症。这种差异挑战了传统的结构-活性关系范式。这两种化合物最终都削弱了抗菌能力。为了阐明这一机制，我们进行了整合转录组学和代谢组学分析，发现不同的表型与能量相关通路的差异调节有关，包括糖酵解和嘌呤代谢。分子对接预测AMPK是一个潜在的共同靶点，随后的分子动力学模拟提供了关键的动态视角：TPHP迅速从AMPK上解离，而TOCP则保持了更持久的相互作用。这种不同的结合稳定性为它们不同的免疫代谢重编程提供了合理的机制基础。总体而言，这些发现表明，结构相似的TOCP和TPHP在斑马鱼中诱导了不同的免疫毒性，这可能是通过早期先天免疫阶段宿主能量代谢的差异性破坏来介导的。

引言

芳基有机磷阻燃剂，尤其是TPHP和TOCP，常被用作塑料、消费品和工业产品的添加剂（Hao等人，2019；Vermeulen、Schymanski、Barabási和Miller，2020）。它们的广泛应用导致在全球水生环境中频繁检测到这些化合物。在典型条件下，这两种化合物的浓度相对较低，通常在表面水中为ng/L到μg/L之间（Estill、Slone、Mayer、Chen和La Guardia，2020；Q. Liu等人，2022）。虽然TOCP通常以微量存在（例如，在黄河中的浓度为ND–6.26 ng/L）（Han等人，2021），但TPHP在严重污染的河流中可以达到极高的浓度（例如，高达44 mg/L）（Vasseghian、Alimohamadi、Khataee和Dragoi，2022）。重要的是，这两种化合物都具有显著的生物累积潜力。对于TPHP，其在成年斑马鱼中的脂质重量基生物浓缩因子（BCFlw）范围为1925至5474（Guowei Wang等人，2017）。TOCP的生物累积潜力更强，其BCF高达59888 L/kg•dw（在淡水蛤蜊Corbicula fluminea中测量），超过了欧洲化学品管理局对高生物累积化合物的阈值（≥ 5000 L/kg•dw）（Mata等人，2022）。这种环境中的普遍存在和持久性突显了对水生生物的潜在毒性威胁，已有研究报道了它们的生殖和发育毒性、内分泌干扰、神经毒性和心脏毒性（X. Li等人，2025；Y. Li等人，2025；Schmandt、Diduff、Smart和Williams，2024；Yi、Qin、Li、Kong和Liu，2024；Q. Zhang等人，2023）。

然而，aryl-OPFRs的免疫毒性这一关键健康终点仍然是一个未充分探索的领域，阻碍了全面的生态风险评估。新兴的证据，主要来自体外和哺乳动物研究，开始将TPHP暴露与免疫失调联系起来。例如，TPHP已被证明通过激活TLR4介导的ERK/NF-κB通路来诱导巨噬细胞功能障碍（Lin等人，2023）。值得注意的是，环境流行病学研究还发现血清TPHP水平与Sjogren综合征的发病率以及儿童2型炎症生物标志物之间存在正相关（Liao等人，2023；Zeng等人，2023）。此外，在研究TPHP对大鼠和小鼠模型的神经毒性的研究中，也发现了同时发生的免疫损伤，如炎症反应（Hogberg等人，2021；Ji等人，2022）。值得注意的是，我们之前的研究表明，尽管TPHP和TOCP在结构上相似，但它们对人类巨噬细胞产生了不同的免疫毒性效应：分别是免疫抑制和免疫刺激（X. Li、Li、Rao、Huang和Ma，2020）。这种矛盾挑战了结构类似物引发相似生物活性的传统毒理学范式。这种细胞水平的差异得到了早期体内研究的支持，这些研究表明TOCP在鸡和小鼠中具有免疫抑制作用（Brinkerhoff、Sharma和Bourcier，1981；Foil、Chambers、Stinson和Glick，1980），并在我们的后续工作中与Rap1/mTOR信号通路的差异联系起来（B. Zhao等人，2025）。然而，一个关键问题仍然存在：这种细胞水平的差异是否会在整个生物体中表现出来，特别是在广泛暴露的水生物种中。与越来越多的哺乳动物数据相比，来自水生生物的证据很少且描述性较强，只有一项斑马鱼研究证实了黏膜屏障中的免疫毒性效应，而其背后的上游机制仍然不清楚（Yu等人，2024）。此外，TOCP在任何体内系统中的免疫毒性几乎未知。因此，有必要研究在细胞水平上观察到的不同免疫毒性是否会在整个生物体中体现出来，并在生态相关的水生模型中阐明协调这种差异的总体分子网络。

斑马鱼（Danio rerio）幼体为这项研究提供了理想的模型，因为它的免疫发育具有时间上的分离。在早期发育阶段，幼体拥有完全功能的先天免疫系统，包括巨噬细胞和中性粒细胞（Galindo-Villegas，2016），而其适应性免疫尚未发育（Patton、Zon和Langenau，2021）。这种独特的“仅先天免疫”阶段提供了一个简化而强大的系统，可以专门研究污染物对先天防御的直接免疫毒性，而不受适应性免疫的干扰。这使得幼体对免疫毒性物质高度敏感（Rauta、Nayak和Das，2012），因为它们的生存完全依赖于这一关键窗口期间先天免疫系统的功能完整性。此外，新兴的免疫代谢学领域揭示了免疫细胞的激活和功能严重依赖于特定的代谢重编程（Trivedi、Wang和Friedman，2021）。这种复杂的相互作用提示了一种假设，即TPHP和TOCP观察到的不同免疫毒性可能源于它们对宿主代谢的不同破坏。为了验证这一假设并揭示潜在机制，我们采用了整合转录组学和代谢组学的方法，将现象观察与机制洞察联系起来。传统的靶向分析往往不足以捕捉表型和信号分子之间复杂的系统级相互作用。相比之下，多组学整合提供了一个无偏见的视角，可以同时可视化全局转录和代谢变化，从而发现免疫代谢网络中关键但之前被掩盖的机制节点。鉴于斑马鱼和人类之间核心免疫和代谢途径的高度保守性（Russo等人，2023），我们在斑马鱼模型中发现的机制为更广泛的生态和人类健康风险评估提供了有价值的见解。

因此，这项研究直接探讨了TPHP和TOCP的不同免疫毒性是否会在整个生物体中体现出来的根本问题。它还旨在利用斑马鱼幼体作为典型的体内模型，来阐明协调这种差异的总体分子网络。通过利用其时间上分离的先天免疫并整合转录组学和代谢组学分析，我们从机制上剖析了这些结构类似物如何破坏免疫代谢平衡。我们的方法专门设计用于测试它们的不同免疫毒性结果是否源于免疫代谢网络的差异性干扰，从而提供新的机制见解，并支持更准确的生态风险评估。

章节片段

化学品和材料

TPHP和TOCP从Sigma-Aldrich（美国）购买并溶解在DMSO中。同位素内标（¹³C₆-异亮氨酸、¹³C-甲硫氨酸、¹³C₃-丙酮酸和¹³C-乳酸）从Cambridge Isotopic Laboratories购买，TPHP-d₁₅从Aladdin（中国）获得。其他化学品为色谱级或分析级，来自Thermo Fisher Scientific或Sinopharm Chemical Reagent Co。

斑马鱼的护理和暴露

健康的成年野生型鱼（AB）和转基因系（Tg, mpeg1:EGFP和lyz:DsRed）

TOCP和TPHP对斑马鱼幼体的急性毒性和定量

TPHP和TPHP在斑马鱼幼体中的96-h LC₅₀值分别为8.518和8.152 μΜ（图S1），表明这两种结构类似物的急性毒性相当。值得注意的是，文献中报道的TPHP的急性毒性值差异很大。例如，一项研究报告称，暴露于TPHP的斑马鱼胚胎在5-72 hpf时的存活率低于50%（Isales等人，2015），而另一项研究则确定了较晚暴露时的LC₅₀为90.7 μM

意义

内源性代谢和免疫屏障维持之间的复杂相互作用已成为免疫毒性研究的一个新方向，但水生生物中的机制相互作用仍不清楚。为了解决OPFRs在水生生物中的高暴露风险和不清楚的免疫毒性机制，本研究使用了仅依赖其独立先天免疫系统的斑马鱼幼体，以阐明结构相似的aryl-OPFRs的免疫毒性效应

CRediT作者贡献声明

李新燕：撰写——原始草稿，方法学。姚瑶：软件，资源。赖东梅：验证，正式分析。罗丽娟：监督，项目管理。邓洁薇：撰写——审阅与编辑，调查。栾天刚：撰写——审阅与编辑，监督。梁小平：撰写——审阅与编辑，监督，资金获取，概念化

未引用的参考文献

Huang和MacKerell Jr, 2013; Li等人，2025; Soto-Heredero等人，2020; Wang等人，2017; Zhang等人，2023; Zhao等人，2018.

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（编号22306033、22536007和22127810）和广东省基础与应用基础研究基金（2025A1515011481）的支持。