在无缓冲液和Mn2+优化条件下，耦合PPK2的ATP再生系统的L-茶氨酸合成酶的比较评估

《Enzyme and Microbial Technology》：Comparative evaluation of l-theanine synthetases coupled with PPK2 based ATP regeneration under buffer-free and Mn2+ optimized conditions

L-茶氨酸生物合成中，通过表达MmGMAS和ecGCS两种酶并整合PPK2-6 ATP再生系统，在无缓冲、高底物浓度（800 mM）条件下，实现了高效催化转化。实验显示MmGMAS-PPK2-6系统产率达47.9 g/L，ecGCS-PPK2-6系统为44.5 g/L，且ATP消耗减少90%。该研究首次系统比较两种酶的生物合成效率，证实ecGCS在工业应用中的可行性。

　　

余京在（Kyungjae Yu）| 高贤基（Hyun Gi Koh）| 李秉旭（Byung Wook Lee）| 趙亨根（Haeng-Geun Cha）| 金盖尔（Gaeul Kim）| 郑允贞（Yoon Jung Jung）| 申正彬（Jung Bin Shin）| 安正玉（Jung-Oh Ahn）| 楊英勋（Yung-Hun Yang）| 金熙泰（Hee Taek Kim）| 张亨旭（Hyung-Wook Jang）| 孙敏贞（Minjeong Sohn）| 朴世英（See-Hyoung Park）| 朴京文（Kyungmoon Park）

韩国世宗市弘益大学生物与化学工程系，邮编30016

摘要

L-茶氨酸（γ-谷氨酰乙胺）是一种具有生物活性的氨基酸，因其功能和营养保健应用而受到广泛重视。虽然使用γ-谷氨酰甲基胺合成酶（GMAS）的酶法合成已得到广泛研究，但γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（GCS）作为替代生物催化剂的潜力尚未得到充分探索。在本研究中，建立了一种高底物浓度、无需缓冲液的全细胞转化系统，利用表达来自Methylovorus mays的GMAS（MmGMAS）或E. coli的GCS（ecGCS）的E. coli来生产L-茶氨酸，并通过多磷酸激酶2（PPK2）驱动ATP再生机制。基于机器学习催化剂预测工具CatPred的in silico预测表明，ecGCS的催化效率与MmGMAS相当或更高，这一结果与实验结果一致。在测试的六种PPK2变体中，来自Rhodobacter sphaeroides的酶（PPK2-6）被确定为最合适的ATP再生模块，能够在保持高L-茶氨酸产量的同时将ATP消耗量减少约90%。MmGMAS-PPK2-6和ecGCS-PPK2-6系统分别从800 mM底物中产生了47.9 g/L（34.4%）和44.5 g/L（31.9%）的L-茶氨酸。此外，还证实在没有外加缓冲液的情况下L-茶氨酸的生产不受影响，这可能有助于后续处理。这项工作首次展示了在工艺相关条件下使用天然ecGCS高效生产L-茶氨酸的可能性，并强调了其作为GMAS基生物合成方法的补充或替代方案的潜力。

引言

L-茶氨酸（γ-谷氨酰乙胺）是一种非蛋白质生成的氨基酸，最初在茶叶中发现，它为绿茶特有的鲜味做出了贡献[1]、[2]。除了其感官作用外，L-茶氨酸还因其有益的生理效应而受到关注。研究表明，摄入L-茶氨酸与放松、神经保护作用和其他健康益处有关[1]、[2]、[3]、[4]。因此，L-茶氨酸现在被广泛用作功能性食品成分和营养补充剂，从而推动了成本效益高的生产方法的需求[5]。

L-茶氨酸的工业生产通常通过化学合成或L-谷氨酸（或L-谷氨酰胺）与乙胺的酶促缩合来实现[6]。然而，使用游离乙胺作为底物存在实际挑战，因为乙胺是一种易挥发且有毒的化合物，需要特殊处理并增加生产成本[6]。这些问题促使人们开发出能够减少有害物质输入同时最大化L-茶氨酸产量的生物合成工艺。

早期的L-茶氨酸酶法生产方法主要集中在使用L-谷氨酰胺作为谷氨酰供体的γ-谷氨酰转移反应上。例如，细菌L-谷氨酰胺酶和γ-谷氨酰转移肽酶（GGT）可以直接将γ-谷氨酰基团从谷氨酰胺转移到乙胺上，形成L-茶氨酸[7]。尽管这些基于谷氨酰胺的方法可以生产L-茶氨酸，但它们需要昂贵的L-谷氨酰胺作为底物，并且还会产生显著的副反应，包括谷氨酰胺水解和形成非目标γ-谷氨酰衍生物[7]、[8]。

为了克服这些缺点，研究人员转向了更经济的基于谷氨酸的途径。他们寻找能够以ATP依赖的方式直接将廉价的L-谷氨酸与乙胺结合的酶，类似于茶叶中发现的L-茶氨酸合成酶[5]。最初的尝试使用了微生物谷氨酰胺合成酶（GS；EC 6.3.1.2），其中一些酶具有接受烷基胺代替氨的轻微副反应[9]。Tachiki及其同事使用来自Pseudomonas taetrolens Y-30的GS与面包酵母开发了一种耦合发酵工艺，通过ATP再生，在优化条件下从谷氨酸和乙胺中生产出高达约30 g/L的L-茶氨酸[9]。然而，野生型GS酶的乙胺结合活性较低，使用氨时仅达到正常活性的几个百分点[9]。这种低活性限制了基于GS的途径的效率和可扩展性，促使人们寻找对乙胺更具反应性的替代酶[10]。

L-茶氨酸生物催化领域的一个重大突破是在利用甲胺的细菌中发现了γ-谷氨酰甲基胺合成酶（GMAS；EC 6.3.1.11）。GMAS最初从Methylophaga和Methylovorus物种中分离出来，能够自然催化L-谷氨酸与甲胺或乙胺的ATP依赖性缩合，形成相应的γ-谷氨酰胺[11]。Yamamoto等人报告称，来自Methylovorus mays No. 9的表达MmGMAS的菌株在耦合酵母发酵中从谷氨酸和乙胺中产生的L-茶氨酸量显著高于基于GS的系统，达到约110 g/L的浓度[12]。此外，Fan等人通过引入二硫键改良了MmGMAS的稳定性，使其在40°C下的半衰期延长了约六倍[13]。在最佳条件下并利用ATP再生时，这种稳定的变体从800 mM的总底物中产生了约645 mM的L-茶氨酸（112.5 g/L）[13]，表明基于GMAS的全细胞转化可以在工业应用相关的条件下实现高L-茶氨酸浓度。

另一种有前景的L-茶氨酸生产酶法涉及γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（GCS；EC 6.3.2.2），这是E. coli中谷胱甘肽生物合成途径中的第一个酶。天然E. coli酶ecGCS是一种强健的、 constitutively表达的蛋白质，通常通过γ-肽键将L-谷氨酸和L-半胱氨酸连接起来[14]（图1A）。然而，Miyake和Kakita发现，ecGCS也能在静止的E. coli细胞中缩合谷氨酸和乙胺形成L-茶氨酸，内源性代谢提供ATP[15]。这种基于GCS的系统仅从414 mM的谷氨酸中产生了约12 mM的L-茶氨酸（约2.1 g/L），并产生了γ-谷氨酰丙氨酸作为副产物[15]，表明尽管GCS途径在机制上是可行的，但其催化效率低且对乙胺的特异性有限，需要改进[14]。尽管如此，ecGCS作为L-茶氨酸催化剂具有实际优势，不仅因其表达水平，还因其结构特性。这些发现证实了ecGCS接受乙胺的机制可行性，并推动了进一步的活性和特异性工程研究。此外，ecGCS是E. coli中的内源酶，可以在重组菌株中轻松过表达[14]，其结构和活性位点结构已被充分研究，为提高对乙胺的特异性提供了坚实的基础[16]。相应地，已经探索了蛋白质工程来改善ecGCS在受控反应条件下对乙胺的L-茶氨酸形成性能[14]。与谷氨酰胺合成酶（GS）变体相比，后者的乙胺结合活性相对于其天然活性较低[9]，ecGCS是一个高度可工程的支架，具有明确的改进L-茶氨酸生产和选择性的潜力[14]、[15]、[16]。

在这项研究中，在高底物浓度的全细胞转化条件下对基于MmGMAS和ecGCS的催化剂进行了比较评估。为了降低这些依赖ATP的反应的ATP需求并提高经济可行性，采用了基于多磷酸激酶2（PPK2）和无机多磷酸盐的ATP再生系统，该系统先前已被证明对L-茶氨酸生产有效[17]、[18]。此外，还研究了无需缓冲液的反应条件，以进一步简化工艺并增强其经济潜力。特别是，本研究考察了在工艺相关条件下，较少研究的基于ecGCS的途径是否能够与已建立的MmGMAS途径表现相当。这项工作首次系统地比较了两种主要酶法在工艺相关条件下的L-茶氨酸合成途径，并证明天然ecGCS可以作为工业L-茶氨酸生产的可行替代平台。

部分摘录

细菌菌株和质粒

所有重组酶的生产均使用E. coli BL21(DE3)作为宿主菌株。编码MmGMAS（来自Methylovorus mays的γ-谷氨酰甲基胺合成酶，1335 bp [12]）、ecGCS（来自E. coli的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶，1557 bp [14]）和RhGMAS（来自Rhodovulum sp的GMAS，1293 bp [19]）的L-茶氨酸生物合成基因以合成片段或PCR扩增片段的形式获得，并克隆到T7启动子驱动的表达载体pET24ma（Kan^R）中（补充表S1）。

在高底物条件下筛选L-茶氨酸合成酶

L-茶氨酸合成酶催化的L-茶氨酸形成的总体反应机制如图1B所示。使用CatPred进行in silico分析以估计候选L-茶氨酸合成酶的动力学参数，预测的k_cat、K_m和k_cat/K_m值针对盐酸乙胺和MSG在表2中总结。对于盐酸乙胺，ecGCS（13.67 s^-1·mM^-1）和MmGMAS（11.30 s^-1·mM^-1）的预测催化效率相当，

结论

本研究首次系统地比较了MmGMAS和ecGCS在L-茶氨酸生物生产中的全细胞途径，并确定了支持两种酶高产量合成的共同工艺条件。在优化的无缓冲液条件下，使用800 mM底物、60 mM MnCl2、100 mM polyP6和20 mM ATP时，MmGMAS–PPK2-6和ecGCS–PPK2-6菌株分别产生了47.9 g/L和44.5 g/L的L-茶氨酸，而所需的ATP量仅为初始条件的约10%

作者声明

所有作者声明本文为原创作品，之前未发表过，目前也没有在其他地方考虑发表。所有作者同意将本文提交给Enzyme and Microbial Technology。所有作者确认本文不存在利益冲突，且没有重要的财务支持影响其结果。所有作者确认本文已阅读完毕

CRediT作者贡献声明

郑允贞（Yoon Jung Jung）：研究、数据管理。申正彬（Jung Bin Shin）：研究、数据管理。安正玉（Jung-Oh Ahn）：撰写 – 审稿与编辑、监督。赵亨根（Haeng-Geun Cha）：验证、方法学、研究、数据分析。金盖尔（Gaeul Kim）：研究、数据管理。朴世英（See-Hyoung Park）：撰写 – 审稿与编辑、监督、项目管理、资金获取、概念构思。高贤基（Hyun Gi Koh）：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、验证、方法学、研究、资金支持

致谢

本研究得到了韩国贸易、工业与能源部（MOTIE）资助的研究与开发计划（20018337）和技术创新计划（RS-2024-00432188、RS-2025-13482968和RS-2025-02219753）的支持。