来自Enterocloster bolteae JCM 12243T的Urolithin 9-脱氢酶能够催化尿石素（urolithins）的区域特异性脱氢反应

《Enzyme and Microbial Technology》：Urolithin 9-dehydroxylase from Enterocloster bolteae JCM 12243T catalyzing regiospecific dehydroxylation of urolithins

刘易斯酸代谢|urolithin A合成|肠道菌群|酶纯化|底物特异性

　　

作者名单：冈泽香奈子（Kanako Kumazawa）、渡边广子（Hiroko Watanabe）、中岛隆典（Takanori Nakajima）、千叶夏野（Natsuno Chiba）、山本宏明（Hiroaki Yamamoto）、岸野茂信（Shigenobu Kishino）、小川淳（Jun Ogawa）

所属机构：日本京都大学农业研究生院应用生命科学系

摘要

尿石素是一类由鞣花酸衍生的代谢物，鞣花酸存在于包括石榴在内的多种植物中，其转化过程由肠道微生物催化完成。其中，尿石素A具有抗氧化和抗炎作用，并能促进自噬作用，因此可能对人类健康有益。从人类粪便中分离出的肠球菌属菌株Enterocloster bolteae JCM 12243 T能够将尿石素C转化为尿石素A。在之前的研究中，已通过蛋白质组学或转录组学分析确定了该菌株中编码尿石素C脱氢酶的ucdCFO操纵子（或UcdhABC）。本研究旨在通过从野生型活性菌株的细胞提取物中纯化该酶来进一步明确其催化机制。结果表明，UcdCFO/UcdhABC是该菌株中尿石素C转化为尿石素A的唯一催化剂。为进一步研究该酶的活性，我们从表达优化基因的Rhodococcus erythropolis L88转化体中获得了该酶并分析了其性质。纯化的酶能够催化五种尿石素中第9位羟基的脱氢反应，说明它是一种尿石素9-脱氢酶。动力学分析显示，该酶对尿石素M6的催化活性最高，其活性与尿石素M5和尿石素C相近。该酶在pH 6.5至7.5的范围内以及37°C条件下表现出最佳的转化效果。这些发现为基于发酵的高效生产尿石素A提供了重要依据，而尿石素A具有促进健康的功效。

引言

尿石素是一类多酚类物质，属于从鞣花单宁（存在于石榴、草莓、核桃、栗子和黑莓等植物中的化合物）中通过肠道微生物作用转化而来的代谢产物[1]。当鞣花酸在肠道中被释放后，会进一步被多种微生物转化为尿石素[2]。如图S1所示，尿石素经历了复杂的微生物代谢过程。迄今为止，已在人体肠道中鉴定出14种类型的尿石素[3][4][5]。其中，尿石素A和B具有抗氧化、抗炎和抗癌等药理活性[6][7][8]，并且尿石素A还被证实能激活自噬作用[9][10][11]。阐明尿石素A和B的代谢机制有助于开发促进肠道健康的功能性食品和药物。 先前的研究表明，Gordonibacter urolithinfaciens DSM 27213 T和G. pamelaeae DSM 19378 T能将鞣花酸转化为尿石素M5、M6和C[12]；Ellagibacter isourolithinfaciens DSM 104140 T可产生尿石素M5、M6、C和isourolithin A[13][14]；Enterococcus faecium FUA027能将鞣花酸转化为尿石素C和A[15]；Bifidobacterium pseudocatenulatum INIA P815能生成尿石素A和B[16]；而Enterocloster bolteae CEBAS S4A9 DSM 15670 T和DSM 29485能将尿石素C转化为尿石素A；E. asparagiformis DSM 15981 T和E. citroniae DSM 19261 T则能将尿石素M6转化为尿石素A[17]。 近年来，来自肠道细菌的尿石素转化酶受到了越来越多的关注。例如，Bae等人[25]和Pidgen等人[18][24]分别鉴定出G. urolithinfaciens DSM 27213 T中的Eah、Eadh1和Eadh2酶，它们分别是鞣花酸脱羧酶、尿石素4-脱氢酶和尿石素10-脱氢酶；E. isourolithinfaciens DSM 104140 T中的Eadh3酶为尿石素8-脱氢酶；E. bolteae DSM 15670 T中的UcdCFO/UcdhABC酶为尿石素9-脱氢酶；E. asparagiformis DSM 15981 T中的UxdFOC酶也为尿石素10-脱氢酶。这些发现凸显了人们对肠道细菌所携带的尿石素转化酶的兴趣。目前所有鉴定出的酶均为可诱导表达的酶，其鉴定方法主要基于转录组和蛋白质组学分析。相比之下，基于从野生型活性菌株细胞裂解物中纯化酶的鉴定方法较为少见。 我们从野生型Enterocloster bolteae JCM 12243 T（即DSM 15670 T）中纯化了尿石素C脱氢酶，并确定了纯化蛋白的N端氨基酸序列。研究结果表明，先前研究中鉴定出的UcdCFO/UcdhABC确实是该菌株中尿石素C转化为尿石素A的唯一催化剂。我们进一步利用重组酶对该酶进行了表征，这些结果进一步支持了之前的研究结果，并为优化尿石素A的生产工艺提供了依据。

化学试剂和细菌菌株

尿石素是根据先前报道的合成方法制备的[19]；其他所有化学试剂均为分析级且可商业购买。Enterocloster bolteae JCM 12243 T购自日本理化学研究所（RIKEN，茨城县）。Rhodococcus erythropolis L88菌株来自北海道系统科学研究所（北海道，日本）（见表S1）。

厌氧条件

实验中采用了三种不同的厌氧条件。

从Enterocloster bolteae JCM 12243 T中纯化尿石素C脱氢酶

使用含有1 mM DTT的20 mM磷酸钾缓冲液（pH 6.5），通过硫酸铵沉淀法从可溶性CFE组分中纯化了尿石素C脱氢酶，随后通过连续色谱步骤进行分离（见图S3–5）。通过以5 mM NADH作为电子供体，验证了该酶能将尿石素C转化为尿石素A。纯化酶的总产率为1.9%，其特异性活性提高了27倍（见表1）。

讨论

本研究的目的是从Enterocloster bolteae JCM 12243 T中纯化尿石素C脱氢酶，并对其性质进行表征。我们从野生型菌株中纯化了该酶，并分析了最终纯化产物中四种蛋白质的N端氨基酸序列。其中三种序列与先前通过ucdCFO操纵子（ucdhABC）编码的尿石素C脱氢酶的基因产物一致。

资助信息

本研究得到了新能源产业技术发展组织（NEDO）、JST SPRING项目（项目编号JPMJSP2110）以及日本学术振兴会（JSPS）科研费（项目编号JP21K19075和JP24H00501）的资助。

伦理声明

由于本研究仅涉及微生物实验，未涉及人类参与者或动物实验，因此无需伦理审批。

作者贡献声明

小川淳（Jun Ogawa）： 负责撰写、审稿与编辑、实验验证、项目管理、方法设计、资金申请、数据管理及概念构思。 山本宏明（Hiroaki Yamamoto）： 负责撰写、审稿与编辑、实验监督、资源调配、方法设计、数据管理及概念构思。 岸野茂信（Shigenobu Kishino）： 负责撰写、审稿与编辑、实验验证、方法设计、资金申请、数据管理及概念构思。 中岛隆典（Takanori Nakajima）： 负责撰写、审稿与编辑、实验验证及资源调配。

利益冲突声明

作者声明不存在任何利益冲突。

致谢

我们衷心感谢山本宏明博士对这项研究的宝贵贡献，尽管他在研究完成前已经离世。本文谨以此文纪念他。同时感谢S. Park博士提供的宝贵建议和技术支持，也感谢Enago公司（网址：www.enago.jp）对论文的英文语言审核工作。