《European Journal of Cell Biology》：TGF-β Drives Pulmonary Fibrosis Through Dual Dysregulation of TNF Pathway Transcription and Splicing
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尽管已知TGF-β信号是肺纤维化（PF）进展的关键驱动者，但其如何通过调控下游转录和选择性剪接（AS）来推进疾病仍不甚明了。本研究在TGF-β诱导的原代小鼠成纤维细胞纤维化模型中，结合RNA-seq、CUT&Tag和Iso-seq技术，系统性地回答了这一问题。研究发现TNF信号通路是纤维化的核心驱动者，SMAD3通过上调转录因子ISL1抑制下游效应基因VCAM1，同时TGF-β刺激导致全基因组AS复杂性降低，尤其是在TNF通路基因（如Vcam1、Vegfd）中。这种TNF信号在转录和剪接水平的双重失调共同抑制了成纤维细胞凋亡，加剧了纤维化进程。该研究揭示了TGF-β/SMAD信号通过协同调控转录组和剪接组驱动肺纤维化的独特机制，为理解疾病发生和寻找新治疗靶点提供了重要见解。
肺，一个看似简单的呼吸器官，却在悄无声息中可能被一种名为肺纤维化（Pulmonary Fibrosis, PF）的慢性疾病所侵蚀。想象一下，肺部原本柔软、充满弹性的肺泡结构，逐渐被坚硬的疤痕组织所替代，就像皮肤受伤后留下的伤疤，这个过程会严重影响肺部的气体交换能力，导致患者呼吸困难、生活质量严重下降，甚至最终走向呼吸衰竭。尽管已有吡非尼酮和尼达尼布等抗纤维化药物应用于临床，但它们的疗效有限且副作用明显，因此，深入探究肺纤维化背后的“罪魁祸首”和作案细节，是科学界迫在眉睫的任务。
在这一病理过程中，转化生长因子-β（Transforming Growth Factor-β, TGF-β）及其下游的SMAD信号通路被公认为是驱动纤维化的“核心指挥官”。它就像一名总指挥，能够“命令”肺部成纤维细胞活化、转变为更具攻击性的肌成纤维细胞，并过量生产胶原蛋白等细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM），最终导致肺部结构僵硬。然而，这位“指挥官”具体是通过调控哪些“关键下属”（下游靶基因）来发号施令的？除了改变基因的“产量”（表达水平），它是否还会篡改基因的“生产图纸”（选择性剪接，Alternative Splicing, AS），从而制造出功能异常的蛋白质，最终推动疾病发展？这些问题，正是本项研究试图揭开的谜团。
为了更贴近真实的人体情况，研究人员没有使用易于培养但可能失真的永生化细胞系，而是精心地从小鼠肺组织中分离出了原代肺成纤维细胞，并用TGF-β进行刺激，成功构建了一个体外肺纤维化模型。这个模型再现了纤维化的关键特征：活化的SMAD3蛋白（p-SMAD3）增多，α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和骨桥蛋白（OPN）等纤维化标志物表达上调。研究人员就像一个侦探团队，运用了多种高科技“侦查工具”来全面分析这个模型：用RNA测序（RNA-seq）绘制基因表达的全局变化图谱；用CUT&Tag技术精确定位激活的SMAD3蛋白在基因组上的“落脚点”；用全长转录本测序（Iso-seq）技术，像高清摄像机一样，无偏差地捕捉所有基因转录本的全貌，精准识别选择性剪接事件。
主要技术方法包括：从小鼠肺组织分离和培养原代成纤维细胞，并使用TGF-β1刺激建立体外纤维化模型。通过RNA-seq对正常组织和纤维化细胞的转录组进行测序和差异分析。利用CUT&Tag技术，结合抗p-SMAD3抗体，在全基因组范围内绘制SMAD3蛋白的染色质结合图谱。采用PacBio平台的Iso-seq（全长转录本测序）技术，无偏好性地鉴定和比较正常与纤维化细胞中的全转录本结构与选择性剪接事件。通过定量PCR、Western blot、半定量RT-PCR和siRNA基因敲低等分子生物学实验对组学分析发现的关键分子和通路进行功能验证。
3.1. 利用TGF-β刺激的原代小鼠肺成纤维细胞建立肺纤维化体外模型
研究人员成功建立了模型，验证了细胞具有成纤维细胞特征（VIMENTIN和COL1A1阳性），并证实TGF-β刺激后，纤维化标志物（α-SMA, OPN, Col1a1, Acta2）表达上调，SMAD3被磷酸化激活，SMAD通路组分（Smad2, Smad4, Smad6, Smad7）表达也发生改变，同时胶原代谢和活性氧水平升高，综合表明纤维化模型构建成功。
3.2. Isl1是TGF-β诱导的肺纤维化中的主要转录调控因子
RNA-seq分析发现，在TGF-β诱导的原代和NIH3T3成纤维细胞中，差异表达基因（DEGs）均显著富集于TNF信号通路，提示该通路是纤维化的保守驱动者。通过交叉数据库分析，鉴定出五个表达改变的转录因子，其中ISL1能调控16%的TGF-β应答差异表达基因，包括TNF通路的关键效应基因Vcam1。在纤维化细胞中，Isl1表达上调，而其潜在靶基因Vcam1表达下调，提示ISL1可能作为TGF-β应答的主调控因子，通过抑制Vcam1等基因促进纤维化。
3.3. TGF-β诱导的P-SMAD3激活增强其与染色质的结合并调控Isl1表达
CUT&Tag-seq分析显示，在纤维化细胞中，p-SMAD3在基因组上的结合位点数量倍增，且这些新获得的结合位点显著富集SMAD结合基序。整合分析发现84个基因同时受p-SMAD3结合且表达改变，其中包括转录因子Isl1。这表明激活的SMAD3能直接结合到Isl1的启动子区域，驱动其转录上调，从而将TGF-β信号与ISL1联系起来。
3.4. Iso-seq数据揭示纤维化原代成纤维细胞中存在大规模选择性剪接变化
Iso-seq分析显示，与正常细胞相比，纤维化细胞发生了全基因组范围内的选择性剪接事件数量显著减少，剪接模式复杂性降低，表现为能产生多类剪接事件或多种转录本异构体的基因数量下降。功能富集分析表明，发生差异剪接的基因与细胞周期、增殖等通路相关。特别值得注意的是，在纤维化细胞中，选择性剪接基因显著富集于TNF信号通路。
3.5. Iso-seq发现了二代测序未检测到的独特选择性剪接事件
比较Iso-seq和RNA-seq数据发现，Iso-seq能检测到更多、更全面的选择性剪接事件和基因。其中，仅被Iso-seq检测到的差异剪接基因（即RNA-seq漏检的）显著富集于TNF信号通路、TGF-β信号通路等关键通路。这凸显了Iso-seq技术在发现复杂剪接变化，特别是与疾病相关通路剪接失调方面的独特优势。
3.6. TNF通路失调抑制肺纤维化中的细胞凋亡
研究人员聚焦于TNF通路中发生显著剪接变化的效应基因Vcam1和Vegfd。Iso-seq和半定量PCR证实，在纤维化细胞中，Vcam1的转录本异构体多样性大幅减少，其第3外显子（编码一个重要的免疫球蛋白样结构域）的包含率显著降低。功能上，纤维化细胞表现出明显的抗凋亡表型：促凋亡因子BAX、CASPASE-9、CASPASE-3的表达和活化形式减少，而抗凋亡因子BCL-2表达增加。这表明TNF通路在转录和剪接水平的失调共同导致了成纤维细胞的凋亡抵抗。
3.7. Isl1-Vcam1轴是纤维化成纤维细胞凋亡抵抗所必需的
功能实验证实了SMAD3-ISL1-VCAM1调控轴的存在及其功能重要性。在纤维化细胞中敲低Isl1，能够逆转Vcam1的表达抑制，并同时将凋亡相关基因的表达模式向促凋亡方向转变。相反，直接敲低Vcam1则会增强细胞的抗凋亡表型。这些结果证明，TGF-β/SMAD3通过上调ISL1来抑制VCAM1的表达，是维持纤维化成纤维细胞凋亡抵抗状态的关键机制。
结论与意义
本研究系统性地揭示了TGF-β/SMAD信号通路驱动肺纤维化的一个新颖而协调的双重机制。研究发现，TNF信号通路是不同成纤维细胞模型中保守的纤维化驱动通路。在机制上，激活的SMAD3直接结合并上调转录因子ISL1的表达，而ISL1进而抑制了TNF通路关键效应分子VCAM1的转录。与此同时，TGF-β刺激引发了全基因组水平的选择性剪接复杂性降低，呈现出从“复杂模式”向“简单模式”的转变，其中TNF通路基因（如Vcam1和Vegfd）的剪接多样性丧失尤为显著。这种在转录水平和转录后剪接水平上对TNF通路（特别是Vcam1）的双重失调，共同削弱了细胞的正常凋亡程序，导致成纤维细胞获得凋亡抵抗能力，从而持续存活并过度分泌细胞外基质，最终加剧肺纤维化的病理进程。
这项发表于《European Journal of Cell Biology》的研究具有多重重要意义。首先，它超越了TGF-β调控ECM相关基因的传统认知，将其作用范围扩展至协调转录组和剪接组，并精细调控如VCAM1这类涉及免疫细胞粘附和血管炎症的分子。其次，研究强调了在纤维化背景下，选择性剪接的全局性重编程是一个此前被低估的重要病理层面对此，高分辨率的Iso-seq技术发挥了不可替代的作用。最后，研究鉴定出的SMAD3-ISL1-VCAM1信号轴以及TNF通路的双重失调，为肺纤维化的治疗提供了新的潜在干预靶点。针对该轴上的关键节点（如ISL1或VCAM1的剪接调控）进行干预，可能有助于恢复成纤维细胞的正常凋亡敏感性，从而为开发更有效的抗肺纤维化策略开辟了新途径。
