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脊髓损伤修复中星形胶质细胞重编程为运动神经元样细胞的研究发现4F鸡尾酒（Ascl1-Myt1l-Pou3f2-Isl1）能诱导大鼠和人类反应性星形胶质细胞向运动神经元样细胞分化，其标志物表达及功能特性验证了重编程的有效性。
杨瑞云|沈建宏|金鹏杰|姚琪|陈思颖|吴天琪|常素妍|潘静颖|陈颖|陈刚
中国江苏省南通市南通大学医学院组织胚胎学系，邮编226001
摘要
将脊髓星形胶质细胞重编程为运动神经元在脊髓损伤的再生医学中具有巨大潜力。我们发现了一组四种转录因子——无毛-盾状复合体同源物1、髓鞘转录因子1类似物、POU类3同源框2和ISL LIM同源框1，这些因子统称为4F混合物。4F混合物能够将大鼠和人类的反应性星形胶质细胞重编程为类似运动神经元的细胞。这些重编程后的细胞表现出神经元形态，并且对微管相关蛋白2（MAP2，一种神经元特异性标记物）和胆碱乙酰转移酶（一种已知的运动神经元特异性标记物）呈阳性反应。在4F混合物介导的星形胶质细胞重编程早期，定量实时逆转录聚合酶链反应显示星形胶质细胞基因胶质纤维酸性蛋白的表达受到抑制。此外，在5天内，神经前体细胞标记物SRY-box转录因子2和神经细胞粘附分子1的表达上调，而在7天内，运动神经元前体标记物少突胶质细胞转录因子2被激活。进一步研究表明，使用4F混合物诱导后，重编程细胞中神经基因Map2、突触素I、微管β-3和神经丝重链的表达增加，同时运动神经元基因ISL LIM同源框1、运动神经元和胰腺同源框1、LIM同源框3以及NK6同源框1的表达也增加，运动神经元的存活率也有所提高。更重要的是，4F混合物重编程后的类似运动神经元的细胞能够释放乙酰胆碱，并对谷氨酸诱导的兴奋毒性表现出敏感性。我们的研究结果表明，4F混合物首先将脊髓星形胶质细胞重编程为类似神经前体细胞和运动神经元前体细胞的中间可塑状态，然后进一步发育为类似运动神经元的细胞。
引言
脊髓损伤（SCI）会损害并破坏脊髓中的神经元，导致运动和感觉功能受损，随后引发炎症和瘢痕形成[1]、[2]、[3]。SCI影响全球许多人[4]、[5]。然而，成人的脊髓无法生成新的神经元，这使得SCI的治疗变得非常困难。因此，找到有效补充神经元（尤其是运动神经元）的策略是治疗SCI的关键步骤[6]、[7]。
研究人员已经使用干细胞疗法来应对SCI导致的神经元大量损失问题，但免疫反应和伦理问题使得干细胞技术的发展面临挑战[8]。最近，体细胞重编程技术引起了科学家的关注。重编程技术是指通过生物技术将来自丰富且易于获取的体细胞直接转化为神经元和其他目标细胞。研究发现，某些转录因子在诱导体细胞向神经元转化方面具有巨大潜力[9]、[10]。无毛-盾状复合体同源物1（Ascl1）在神经元分化和神经发生中起着关键作用[11]。作为先导因子，Ascl1启动了神经元重编程过程[12]。研究表明，Ascl1可以在体外和体内将背侧中脑星形胶质细胞重编程为神经元[13]。与激活因子Ascl1不同，髓鞘转录因子1类似物（Myt1l）则抑制许多非神经元类型的细胞分化[14]。Ascl1和Myt1l相互补充，共同决定神经元的命运。此外，POU类3同源框2（Pou3f2）转录因子在神经元分化中也非常重要[15]。在体外条件下，通过过表达Pou3f2可以将皮质星形胶质细胞转化为功能性神经元和神经前体细胞（NPCs）[16]。此外，通过结合使用Ascl1、Myt1l和Pou3f2，可以在体外将成纤维细胞重编程为神经元[17]。ISL LIM同源框1（Isl1）与神经发生素2（Ngn2）、SRY-box转录因子11（Sox11）和LIM同源框3（Lhx3）一起使用，可以直接在体外将人类成纤维细胞重编程为运动神经元[18]。然而，目前尚无关于这四种转录因子（Ascl1-Myt1l-Pou3f2-Isl1，即4F混合物）对星形胶质细胞重编程联合效应的研究。因此，需要进一步的研究来探索这种组合的潜力。
在脊髓中，星形胶质细胞数量丰富，积极参与维持稳态和调节神经回路活动。然而，在损伤后，星形胶质细胞的增殖以及损伤部位瘢痕组织的形成成为阻碍轴突再生和功能恢复的主要障碍[19]、[20]。运动神经元的主要功能是控制肌肉运动。运动神经元是一种独特的神经元亚型，这些细胞的退化或丧失是SCI的特征[21]。因此，补充运动神经元可能有助于SCI模型动物的运动功能恢复[7]、[18]。因此，关键在于找到促进受损脊髓中神经元再生和功能恢复的有效策略。重编程后的细胞可以用于SCI的治疗[22]、[23]、[24]。一种有前景的方法是将星形胶质细胞重编程为运动神经元，用于SCI的细胞移植治疗。在本研究中，我们假设称为4F混合物的一组因子可能在星形胶质细胞的重编程中发挥积极作用；因此，我们旨在探索4F混合物在诱导类似运动神经元细胞方面的潜力。
我们成功发现，在我们建立的体外模型中，同时表达4F混合物足以将大鼠和人类的反应性脊髓星形胶质细胞转化为类似运动神经元的细胞（见图1）。这一发现对于SCI的修复具有重大意义，因为这些由4F混合物诱导的星形胶质细胞衍生的运动神经元可以移植到SCI模型中。此外，我们的研究表明，受伤脊髓中的驻留星形胶质细胞可能通过特定的因子组合被重编程为运动神经元。这一发现为利用星形胶质细胞衍生的运动神经元进行原位修复SCI提供了新的可能性。总体而言，我们的研究为SCI的修复提供了新的策略和理论基础。
部分内容摘录
病毒载体构建
为了构建慢病毒载体，将大鼠的Ascl1、Myt1l、Pou3f2和Isl1基因亚克隆并插入pLenti-Gfap-EGFP-CMV-MCS载体（OBiO Biotechnologies）中。将人类的ASCL1、MYT1L、POU3F2和ISL1基因亚克隆并插入pLenti-GFAP-EGFP-CMV-MCS载体（OBiO Biotechnologies）中。这些基因的表达由胶质纤维酸性蛋白（GFAP）启动子控制[7]。该慢病毒载体编码增强了绿色荧光蛋白（EGFP）[25]。
原代大鼠脊髓星形胶质细胞的激活
我们使用原代脊髓星形胶质细胞进行4F混合物重编程实验。为了模拟SCI后体外观察到的反应性星形胶质细胞的特征，我们使用LPS激活原代大鼠脊髓星形胶质细胞。24小时后，对照组和LPS处理的星形胶质细胞都表达了GFAP，这是星形胶质细胞的经典标记物。LPS处理的星形胶质细胞表现出GFAP强度增加和肥大形态（图2A）。同时，Gfap mRNA的表达显著上调
讨论
运动神经元主要存在于脊髓中，它们的退化或丧失是SCI的特征[34]、[35]、[36]。研究表明，补充运动神经元对促进SCI后的功能恢复具有显著的治疗效果[7]、[35]。在SCI发生后，多种类型的细胞会被激活，包括星形胶质细胞、NG2-胶质细胞、室管膜细胞、周细胞、小胶质细胞和成纤维细胞，这些细胞会增殖、迁移，并在损伤部位及其周围形成纤维胶质瘢痕
CRediT作者贡献声明
陈刚：概念设计。陈颖：写作 – 审稿与编辑。潘静颖：写作 – 审稿与编辑。常素妍：监督。吴天琪：监督。陈思颖：监督。姚琪：实验研究。金鹏杰：实验研究。沈建宏：软件与数据管理。杨瑞云：写作 – 初稿撰写，方法学设计
利益冲突
作者声明本研究是在没有任何可能被视为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。
利益冲突声明
作者声明本研究是在没有任何可能被视为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。
致谢
我们感谢国家自然科学基金（编号82101455、31872773、81971763）、江苏省高等教育机构优先学术发展计划（PAPD）、南通市第十四个五年科学、教育与健康项目（NTCXTD48）以及南通市市民科学技术项目（MS2023045）和江苏省高校大学生实践创新培训项目（202410304124Y）的支持。
