《Experimental Cell Research》：DIFFERENTIAL REGULATION OF EMT-RELATED PATHWAYS BY INFLAMMATORY MICROENVIRONMENT IN 3D PROSTATE SPHEROIDS AND TUMOR-STROMA INTERACTION MODELS
编辑推荐：
前列腺癌慢性炎症通过调控EMT相关分子驱动肿瘤进展，本研究优化了3D前列腺球体和上皮-成纤维细胞共培养模型，发现3D球体中炎症显著上调纤维连接蛋白、波形蛋白和TWIST1，增强侵袭性；共培养模型揭示基质细胞通过改变细胞迁移和抗凋亡能力影响炎症介导的EMT。这些模型为解析炎症-EMT机制及开发靶向疗法提供新平台。
Fersu G.A. CALISIR|Suleyman ARZIMAN|Elif ISEL|Bilge DEBELEC-BUTUNER
埃杰大学，药学院，制药生物技术系，伊兹密尔，土耳其
摘要
慢性炎症在前列腺癌（PCa）的发病、进展和转移过程中起着重要作用，它通过驱动上皮-间质转化（EMT）等肿瘤发生过程来发挥作用。为了在生理相关环境中研究这些机制，我们优化了两种互补的体外肿瘤模型：一种模拟多细胞相互作用的3D前列腺球体模型，另一种反映炎症条件下肿瘤-基质关键动态的上皮-肌成纤维细胞共培养系统。我们的优化结果表明，球体的成功形成依赖于特定细胞系的分子特征，而不是一个通用的球体大小。与传统2D培养相比，炎症刺激以细胞系依赖的方式显著调节了EMT相关因子；特别是，纤维连接蛋白、波形蛋白和TWIST1在3D球体中的表达存在差异，这表明炎症信号增强了肿瘤的侵袭性。共培养模型成功再现了反应性基质的形成，而基质的影响显著影响了炎症诱导的细胞凋亡抵抗性和细胞迁移。总体而言，我们的发现表明肿瘤-基质相互作用对炎症对PCa中EMT的影响至关重要。我们优化的3D球体和共培养模型为揭示炎症的功能后果提供了一个强大而可靠的平台，并为理解PCa进展的细胞过程提供了机制上的见解，有助于开发针对性的治疗策略。
引言
在癌症发生机制的研究和抗癌药物的开发中，易于应用的癌症模型是非常需要的。近年来，已经开发出了3D球体和类器官模型，以更好地在细胞培养中模拟多种类型的癌症，包括前列腺癌[1]、[2]。研究表明，3D细胞培养在模拟细胞间相互作用方面比2D培养更有效[3]。此外，为了更好地模拟上皮来源的肿瘤细胞与其他微环境成分（如基质成纤维细胞、肿瘤相关巨噬细胞和肿瘤浸润淋巴细胞）之间的相互作用，还使用了包括肿瘤-基质和肿瘤-免疫系统模型在内的共培养模型[4]、[5]、[6]。
前列腺癌是男性中第二常见的癌症[7]、[8]（世界卫生组织，2021年）。雄激素剥夺疗法最终会导致疾病转变为雄激素独立的转移性癌症，即去势抵抗性前列腺癌（CRPC）[9]。前列腺组织炎症环境中的分子变化是前列腺癌发生的基本原因之一。包括我们项目团队之前的数据在内的研究表明，慢性炎症对前列腺癌的发病、进展和血管生成有显著影响，从而影响肿瘤微环境的动态[10]、[11]。此外，由于已知慢性炎症会触发上皮-间质转化（EMT），因此炎症微环境不仅在肿瘤的初始阶段起着关键作用，而且在肿瘤向转移阶段的转变中也起着重要作用[7]、[12]。炎症细胞促进了血管生成、DNA损伤、细胞骨架重塑和细胞外基质（ECM）的降解，从而创造了促进肿瘤生长的微环境[7]、[14]（图1）。
炎症条件会触发肿瘤微环境中免疫细胞和基质细胞释放分子介质，从而促进肿瘤进展。转化生长因子-β（TGFβ）是一种在反应性基质中释放的炎症细胞因子，可诱导EMT过程。肿瘤坏死因子-α（TNFα）是一种生理细胞因子，是急性和慢性炎症的主要介质，它能刺激多种细胞因子和趋化因子的释放。大量研究表明，与癌症相关的慢性炎症是一个关键的介质，可以支持肿瘤生长和转移[12]、[15]。尽管肿瘤内存在多种不同类型的细胞，但几乎50%的肿瘤质量由巨噬细胞组成。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是炎症肿瘤微环境中的主要参与者，在肿瘤中大量存在。TAMs最初可以通过释放细胞因子来杀死肿瘤细胞。然而，TAMs持续释放细胞因子、生长因子和ECM蛋白（IL-6、VEGF）会导致肿瘤细胞增殖、血管生成和转移扩散[12]。
在前列腺的炎症微环境中，TNFα和白细胞介素-1β（IL-1β）会诱导NKX3.1蛋白的蛋白酶体降解，NKX3.1水平的降低与前列腺癌的发展有关[16]。NKX3.1在控制前列腺上皮细胞的生长和分化中起着重要作用[17]。NKX3.1表达的丧失与前列腺癌的发展有关，因此它已被确定为具有肿瘤抑制功能的前列腺癌标志物[18]。关于NKX3.1的细胞内功能的研究表明，它作为激活剂或抑制剂来调控与EMT、血管生成、细胞生长和抗氧化反应机制相关的多种蛋白质的水平[19]、[20]、[21]、[22]、[23]。
肿瘤微环境中炎症成分的增加会引发一系列连续的细胞反应，包括细胞因子和趋化因子的表达改变、慢性炎症过程、免疫监视的改变以及最终形成反应性基质。前列腺基质的表型变化通过重新组织肿瘤微环境（如影响血管生成、神经发生和炎症等过程）来影响前列腺癌的发展。这些微环境组成的变化使前列腺基质变得动态和多变。前列腺微环境及其基质的改变通过影响上皮-基质相互作用，从而在前列腺癌的发展中起积极作用[24]、[25]。上皮和基底膜的降解会导致炎症介质的释放。炎症微环境中反应性基质的形成以及随后被激活的基质触发的促炎成分的增加，形成了一个相互促进的相互作用，增强了肿瘤细胞的侵袭性[26]。
正常前列腺组织中上皮与基质之间的相互作用对于维持组织稳态以及调节两种细胞的生长和分化至关重要。上皮细胞和基质细胞产生的生长因子相互调节细胞的生长。此外，基质细胞还调节正常前列腺上皮细胞的分化。
肌成纤维细胞已被确定为前列腺外围区域反应性基质的关键组成部分[26]。慢性炎症细胞分泌的细胞因子会影响这些细胞，导致基质的功能活跃。它们分泌多种特定的生长因子和趋化因子，支持肿瘤生长和转移。组织学上，它们还共同表达波形蛋白、平滑肌α-肌动蛋白（α-SMA）、tenascin-C和前胶原蛋白类型1。
因此，炎症不仅促进了癌症的发病和进展，还通过重塑ECM和触发EMT来促进肿瘤向转移阶段的转变[12]、[24]。然而，研究这些细胞过程显然需要体外细胞培养模型来更好地模拟相关的细胞相互作用。因此，本研究旨在建立优化的3D前列腺癌球体和上皮-肌成纤维细胞共培养模型，提供一个先进的、生理相关的体外平台，以分析炎症对EMT相关分子途径的调节影响。这些模型被用来确定炎症条件是否在3D前列腺球体和上皮-肌成纤维细胞共培养模型中以不同于传统细胞培养方法的方式调节EMT相关分子途径。
部分摘要
细胞培养
所有细胞系均来自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。LNCaP前列腺癌细胞在添加了10% FBS、1% L-谷氨酰胺和1% 青霉素-链霉素（P/S）的RPMI-1640培养基（Gibco，Thermo Fisher Scientific，美国）中培养，培养温度为37°C，二氧化碳浓度为5%。DU145、PC-3和WPMY-1细胞在添加了5% FBS、1% L-谷氨酰胺和1% P/S的DMEM/F-12培养基（Gibco，Thermo Fisher Scientific，美国）中培养，培养温度为37°C，二氧化碳浓度为5%。RWPE-1细胞在...
3D前列腺球体的优化
为了建立适用于炎症相关癌症发生研究的体外3D前列腺球体模型，我们使用了RWPE1（正常前列腺上皮细胞，对雄激素有反应）、LNCaP（前列腺淋巴结转移细胞，对雄激素有反应）、PC3（前列腺癌骨转移细胞，对雄激素无反应）和DU145（前列腺癌脑转移细胞，对雄激素无反应）细胞系。球体在U形底孔培养板上生成3天后，然后转移并进行7天的培养
讨论
能够准确反映肿瘤微环境的体外细胞培养模型是研究癌症机制的重要工具。细胞培养条件可以改变肿瘤成分之间的相互作用，这可能反过来影响不同细胞群体的增殖、分化和形态。前列腺癌球体是一种模拟肿瘤组织机械相互作用的细胞模型，更准确地反映了体内病理生理状况
结论
在这项研究中，我们建立了并优化了3D前列腺癌模型和肿瘤-基质共培养模型，以更好地模拟炎症肿瘤微环境的复杂性。我们的发现表明，在3D相互作用和肿瘤-基质相互作用存在的情况下，细胞对炎症微环境的反应与传统方法相比有显著变化。此外，我们还证明了炎症条件对EMT和干细胞相关基因的轻微影响
CRediT作者贡献声明
Bilge Debelec Butuner：写作 – 审稿与编辑，撰写初稿，监督，项目管理，方法学，概念化。Elif ISEL：写作 – 审稿与编辑，研究，数据分析。Suleyman ARZIMAN：写作 – 审稿与编辑，可视化，研究，数据分析。Fersu G. A. CALISIR：写作 – 审稿与编辑，撰写初稿，研究，数据分析
资助
本研究得到了埃杰大学科学研究项目协调单位（项目编号：27410）和土耳其科学技术研究委员会（TUBITAK）（项目编号：222S863）对BDB的支持。
利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。
