Grhl3调控上皮基因的激活以及成纤维细胞中的表观遗传重塑

《Experimental Cell Research》：Grhl3 Coordinates Epithelial Gene Activation and Epigenetic Remodeling in Fibroblasts

Grhl3在非上皮细胞中通过激活Cdh1及上皮相关转录因子，抑制间充质特征，协同其他MET因子并调控染色质和DNA甲基化，启动早期MET的转录与表观遗传重编程。

　　

?nci Yaprak|Hani Alotaibi

伊兹密尔国际生物医学与基因组研究所，多库泽伊尔九月大学，伊兹密尔，35340，土耳其

摘要

间充质向上皮的转变（MET）是细胞重编程和发育过程中的一个关键且逐步进行的过程。Grhl3已被证明与MET相关，但其在非上皮细胞中启动上皮程序的能力尚未完全明确。在本研究中，我们发现MEFs（小鼠胚胎成纤维细胞）中过表达Grhl3会引发与早期MET一致的转录变化，表现为上皮基因的激活和间充质特征的抑制。这种反应伴随着染色质的变化，表明上皮基因位点的激活，并通过与其他MET相关转录因子的协同作用得到加强。Grhl3还与DNA甲基化的位点特异性变化以及参与表观遗传维持的基因的调控有关。这些发现表明，Grhl3在非上皮环境中是上皮基因激活和表观遗传重塑的核心协调者，支持其在启动早期MET状态中的作用。

引言

上皮向间充质的转变（EMT）及其逆过程——间充质向上皮的转变（MET）是由特定转录因子和染色质调节因子控制的动态且可逆的过程[1]、[2]、[3]。这些转变的一个标志是黏附蛋白的转换，即在EMT过程中E-黏附蛋白（CDH1）丢失而N-黏附蛋白（CDH2）获得，在MET过程中CDH1重新表达[4]。这些过程在发育、细胞重编程和转移性扩散中起着重要作用[5]。特别是MET涉及上皮特征的重新建立，包括上皮基因表达程序的恢复，以及后期阶段的细胞-细胞黏附和顶-基底极性的形成[6]。尽管EMT在发育、纤维化和癌症进展等背景下已被广泛研究，但其启动和进展的分子决定因素仍相对较少被了解[7]。诸如Grhl2、Grhl3、Elf3、Klf4、Ovol2和Cebpα等转录因子已被证实参与了MET的调控[8]、[9]、[10]、[11]、[12]、[13]。Grhl3被认为是一个核心调节因子，它通过激活Cdh1并协调更广泛的上皮基因网络来促进上皮基因程序的启动[9]、[14]。

我们之前已经证明，Grhl3与Hnf4α合作，在TGFβ诱导的NMuMG细胞EMT逆转过程中调节MET[9]。这表明Grhl3可以结合到Cdh1的内含子增强子上，与其启动子相互作用并激活其转录，从而促进上皮基因的重新激活。然而，Grhl3在非EMT背景下独立启动上皮程序的能力仍不清楚。像小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）这样的成纤维细胞提供了一个宝贵的平台，可以在没有先前上皮历史的间充质背景下研究转录因子的功能[11]。这样的系统有助于评估转录因子在启动MET相关转录程序中的充分性，并阐明转录重编程的分子机制。

在这里，我们研究了Grhl3在MEFs中启动MET相关程序的作用，重点关注其上调Cdh1、激活上皮特异性转录因子、抑制间充质基因表达以及调节染色质和DNA甲基化状态的能力。我们还研究了Grhl3与其他MET相关调节因子（包括Elf3、Klf4和Cebpα）之间的协同和定向相互作用。通过基因表达分析、meDIP和ChIP-qPCR技术，我们揭示了Grhl3在MET启动和表观遗传准备中的作用机制。

细胞培养

从C57BL/6J E13.5胚胎中分离出的原代MEFs在含有10%胎牛血清（Gibco, 10270106）、1%青霉素-链霉素（Gibco, 15140122）、1%非必需氨基酸（Gibco, 11140035）和1%丙酮酸钠（PAN-Biotech, p04-43100）的高葡萄糖DMEM（Gibco, 41965039）培养基中培养。细胞在37°C、5% CO₂的湿润培养箱中维持。常规传代时，用PBS（Gibco, 10010023）洗涤细胞，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA（Gibco, 25-200-056）进行解胞。

Grhl3过表达在MEFs中触发早期MET相关的转录反应

为了研究Grhl3是否能在非上皮环境中启动MET，我们在MEFs中过表达Grhl3。定量RT-PCR显示转染后Grhl3 mRNA表达增加了800倍（p < 0.0001），证实了过表达的成功（图1A）。无RT对照组确认Grhl3的扩增来自RNA，而非残留的质粒DNA（图1A）。重要的是，Grhl3过表达显著促进了Cdh1在mRNA水平的表达

讨论

本研究表明，在MEFs中过表达Grhl3会启动一个与早期间充质向上皮转变（MET）相一致的转录程序，表现为上皮基因的上调、间充质标志物的抑制以及在没有成熟上皮结构的情况下的表观遗传准备。与其他MET相关转录因子的功能相互作用，以及染色质和DNA甲基化状态的调节，进一步强化了Grhl3的作用

CRediT作者贡献声明

Hani Alotaibi：撰写——审稿与编辑、监督、资源提供、项目管理、方法学设计、研究实施、资金获取、数据分析、概念构思。?nci Yaprak：撰写——初稿撰写、数据可视化、方法学设计、数据分析、数据管理

伦理批准和参与同意

MEFs的分离遵循欧盟指令2010/63/EU进行，并获得了伊兹密尔生物医学与基因组中心动物实验地方伦理委员会（HAYDEK）的批准，实验方案编号为18/2018。

利益冲突

作者没有需要披露的相关财务或非财务利益。

资助

本研究得到了土耳其科学研究与技术机构（TüB?TAK）的资助（项目编号120N556）。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务或个人利益关系。

致谢

我们感谢Canan Bü?ra Ersayar在质粒制备方面的技术协助，以及IBG光学成像和动物实验设施提供的支持。同时，我们也感谢Mehmet ?ztürk教授和?erif ?entürk教授分享的宝贵试剂。