《Fish & Shellfish Immunology》：The Class B Scavenger Receptor 2 Act as a Proviral Factor in Largemouth Bass Ranavirus infection
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LMBRaV感染中MsSRB2的功能及其与病毒复制的关联性研究。通过体外EPC细胞实验和体内感染实验，发现MsSRB2在脾、肾、肝组织中mRNA表达呈现先升后降趋势，过表达显著抑制LMBRaV复制，而敲低提高宿主存活率并降低病毒载量。揭示MsSRB2可能被病毒利用为内吞受体，通过宿主成分介导实现免疫逃逸，为鱼类病毒病防控提供新理论。
张飞翔|李一群|江楠|黄振宇|孟妍|陈鹏|范玉定|周勇
上海海洋大学渔业与生命科学学院，上海，201306，中国
摘要
大口黑鲈鱼呼肠孤病毒（LMBRaV）是大口黑鲈鱼（Micropterus salmoides）的一种严重流行性病原体，对水产养殖造成了巨大的经济损失。作为先天免疫反应中的关键受体，迄今为止尚未有关于B类清道夫受体成员2（SRB2）在病毒感染过程中功能的报道。本研究发现，M. salmoides的SRB2（MsSRB2）是一个相对保守的序列，具有两个跨膜结构域，与其他脊椎动物的SRB2具有65.41%-98%的序列同源性。定量实时PCR（qRT-PCR）结果显示，MsSRB2主要在心脏中表达，而在脾脏中的表达水平最低。LMBRaV感染后，受感染鱼类脾脏、肾脏和肝脏中的MsSRB2 mRNA水平先升高后降低。在Cyprini乳头状上皮瘤（EPC）细胞中过表达MsSRB2后，该蛋白主要位于晚期内体，并能与LMBRaV的主要衣壳蛋白（MCP）共定位。此外，MsSRB2的过表达显著抑制了LMBRaV在EPC细胞中的复制。相反，在M. salmoides中敲低MsSRB2后，存活率显著提高，脾脏和肝脏中的病毒载量显著减少。基于这些体外和体内实验的结果，我们推测在相关宿主成分存在的情况下，MsSRB2可能被LMBRaV劫持作为细胞内受体，从而促进病毒逃逸并最终增强病毒复制。本研究为理解硬骨鱼类中的病毒-宿主相互作用提供了新的见解，并为开发针对呼肠孤病毒疾病的新型预防和控制策略奠定了理论基础。
引言
大口黑鲈鱼（Micropterus salmoides）属于硬骨鱼纲、鲈形目、中心鱼科，由于其肌肉间的刺较少、营养丰富且生长周期短而具有很高的商业价值。1983年成功人工繁殖并引入广东省佛山市后，M. salmoides被推广到全国各地，成为中国主要的高质量淡水养殖物种[1]、[2]。为了追求更高的养殖产量和经济效益，采用了高密度集约化养殖模式，这容易导致水质恶化、降低鱼类免疫力并引发疾病爆发[3]。大口黑鲈鱼呼肠孤病毒属于Iridoviridae科Ranavirus属，是一种对M. salmoides具有高度致病性的病毒，该病毒是一种有包膜的双链DNA病毒，直径为150-170纳米，基因组大小在100至210千碱基对之间。2021年，我们从湖北实验室分离并鉴定出一种大口黑鲈鱼呼肠孤病毒株，命名为LMBRaV-HB001（LMBRaV）[4]。LMBRaV的主要衣壳蛋白（MCP）占总多肽含量的40%-50%，分子量为50千道尔顿，是鉴定虹彩病毒的重要标志物[3]、[4]、[5]、[6]、[7]。LMBRaV感染会导致高死亡率，目前尚无有效的控制策略，这严重阻碍了M. salmoides养殖业的发展。因此，增强对宿主和病毒相互作用的理解对于预防和控制这种病毒性疾病具有重要意义。
清道夫受体是一类结构多样的糖蛋白，是先天免疫中的重要模式识别受体（PRRs）[8]、[9]、[10]。它们广泛存在于巨噬细胞、血管平滑肌细胞和内皮细胞中。这些受体可以识别多种配体，包括内源性和修饰的宿主来源分子以及微生物病原体[11]、[12]。目前的研究发现清道夫受体分为12个类别（A类至L类）[13]。其中，B类清道夫受体主要包括三种类型：B类清道夫受体成员1（SRB1）、B类清道夫受体成员2（SRB2）和B类清道夫受体成员3（SRB3，也称为分化簇36，CD36）[14]。关于B类清道夫受体的研究主要集中在SRB1和CD36上。大量研究表明，SRB1能够与丙型肝炎病毒（HCV）的包膜糖蛋白E2结合，不仅能够介导HCV的细胞侵入，还能降低抗体对HCV的中和作用，从而促进HCV的免疫逃逸[15]。CD36与脂质代谢、炎症反应、动脉粥样硬化、高胰岛素血症等密切相关，参与肥胖、糖尿病和非酒精性脂肪肝等代谢性疾病的发生和发展[16]。SRB2也称为溶酶体整合膜蛋白2型（LIMP2）或溶酶体膜唾液酸糖蛋白（LGP85），是一种溶酶体膜糖蛋白，最初由Vega等人[17]和Fujita等人[18]分离鉴定。SRB2是一种双跨膜糖蛋白，包含氨基末端、高度糖基化的中间区域和羧基末端[17]、[18]、[19]。研究表明，SRB2可作为β-葡萄糖脑苷脂酶（βGCase）的选择性受体[20]。βGCase是一种重要的溶酶体酶，通过高尔基体将βGCase从内质网转运到溶酶体中，从而在溶酶体内发挥其正常生物学功能[21]。同时，作为手足口病（HFMD）最常见的病原体肠道病毒71（EV71）的受体，SRB2的结合位点位于142至204残基的氨基酸区域，敲低SRB2可以抑制EV71的感染[22]、[23]、[24]。在网格蛋白介导的内吞作用中，病毒受体SRB2锚定在网格蛋白包被的凹陷处，并与EV71一起被内吞到网格蛋白包被的囊泡中[25]。此外，SRB2的糖基化和pH依赖性的构象变化在EV71的附着、进入和脱壳过程中起着关键作用[26]。SRB2还作为Coxsackievirus A16（CVA16）、Coxsackievirus A7（CVA7）和Coxsackievirus A14（CVA14）的受体[27]。然而，迄今为止，关于硬骨鱼类中SRB2的研究仅见于斑马鱼（Danio rerio），主要集中在其对脊椎生长的影响上[28]。SRB2在LMBRaV感染过程中的功能尚不清楚。
本文通过构建MsSRB2真核表达载体和siRNA质粒，在体外和体内研究了MsSRB2在LMBRaV感染过程中的功能，以加深对鱼类病毒感染机制的理解，并为病毒感染的预防提供更多依据。
实验动物、细胞和病毒
M. salmoides从湖北省的一个渔场购买，并在20°C的鱼塘中饲养约两周。实验动物被随机分配到大小相等的组中。Cyprini乳头状上皮瘤（EPC）细胞系在含有10% FBS的Medium 199培养基（Gibco，中国，江苏）中培养，培养温度为25°C。本实验使用的LMBRaV菌株保存在我们的实验室中，并储存在-80°C[3]。
序列比对和系统发育分析
国家生物技术中心
序列比对和系统发育分析
MsSRB2基因的开放阅读框（ORF）长度为1446 bp，编码482个氨基酸（图S1）。MsSRB2编码蛋白的计算分子量为53.8 kDa，理论等电点为5.27。MsSRB2包含两个跨膜结构域（5-27个氨基酸和439-461个氨基酸），在图1中用虚线标出。多重比对显示，MsSRB2与人类、肌肉鼠、Sakesphorus luctuosus的SRB2同源物的整体序列同源性为65.41%-98%
讨论
先前的研究表明，SRB2在人类中广泛表达，尤其是在大脑、脂肪组织、心肌和骨骼肌等组织中高度表达。它在进化过程中具有高度保守性，人类hSRB2与小鼠mSRB2的相似度高达99.9%[27]、[30]。在本研究中，作为双跨膜糖蛋白的MsSRB2在其检测的M. salmoides的六个组织中均广泛表达。此外，SRB2还表现出
伦理声明
本研究获得了中国渔业科学院长江渔业研究所动物实验伦理委员会的批准（内部协议编号YFI2025007）。所有动物实验均按照中国湖北省实验室动物护理和使用监测委员会的指导方针进行。
数据可用性声明
数据可应要求提供。
资金来源
本研究得到了
国家自然科学基金（编号：32202980）、
中央公益性科研机构基础研究基金（编号：YFI202416）、
CAFS（编号：2023TD46）以及新疆维吾尔自治区重点研发任务专项（2024B02014-2）的支持。
利益冲突声明
所有作者均声明没有利益冲突。
