草鱼中的NLRP12类似蛋白2通过破坏NLRP3-ASC炎症小体轴来促进GCRV（草鱼循环病毒）的复制

《Fish & Shellfish Immunology》：Grass carp NLRP12-like 2 facilitates GCRV replication by disrupting the NLRP3-ASC inflammasome axis

草鱼NLRP12-like 2抑制NLRP3-ASC炎症小体，通过降低caspase-1活性及下游炎症因子IL-1β、TNFα和GSDMD表达，削弱宿主抗病毒免疫，促进GCRV复制。

　　

李强 张|肖曼 吴|卢毅 刘|明贤 常

中国武汉，430072，武汉农业科学院

摘要

胞质中的NOD样受体NLRP12是炎症反应的关键调节因子，但其在硬骨鱼类中的功能仍很大程度上尚未被探索。本研究调查了草鱼（Ctenopharyngodon idella）中的NLRP12样蛋白2在GCRV感染期间调节宿主抗病毒免疫反应的功能作用。我们首先证明了NLRP12样蛋白2在体内广泛表达，且其对GCRV感染的转录反应表现出明显的组织特异性。体外功能实验表明，NLRP12样蛋白2在CIK细胞中的过表达显著促进了GCRV的复制，表现为病毒滴度升高、病毒基因（NS38和VP3）表达增强以及病毒诱导的细胞毒性加剧。机制上，NLRP12样蛋白2作为炎性小体通路的强大负调节因子：它抑制了caspase-1的活性，并下调了下游炎症介质（IL-1β、TNFα和GSDMD）的转录。此外，我们发现NLRP12样蛋白2与适配蛋白ASC相互作用，并竞争性地破坏了NLRP3-ASC炎性小体复合物的形成，从而减弱了caspase-1的激活。我们的发现揭示了一种新的机制：NLRP12样蛋白2通过干扰NLRP3-ASC相互作用来抑制caspase-1的激活，进而抑制下游炎症信号传导，为GCRV的复制创造了有利的细胞环境。

引言

草鱼（Ctenopharyngodon idella）是中国淡水养殖业的支柱物种。然而，由草鱼呼肠孤病毒（GCRV）引起的出血性疾病由于其高致病性和高死亡率，已成为制约该行业健康发展的最严重挑战[1]。GCRV的致病性不仅源于病毒直接引起的细胞损伤，还源于宿主免疫反应的复杂失调。在这个过程中，宿主先天免疫反应的及时启动和精确调节是决定感染结果的关键因素[2]。因此，深入理解宿主对GCRV感染的免疫机制对于揭示GCRV感染机制和开发创新的预防控制策略具有重要意义。

在抗病毒先天免疫的前线，NOD样受体（NLR）家族作为感知病原体入侵和危险信号的关键哨兵[3]。在NLRs中，NLRP12因其复杂的、依赖于上下文的调节作用而在哺乳动物中尤为突出[4]。虽然一些NLR成员的功能相对明确，但NLRP12的作用似乎具有双重性：它可以通过抑制NF-κB通路和负调节NLRP3炎性小体组装来发挥抗炎作用[5,6]，但也有证据表明在特定条件下它可能促进炎性小体的激活[7]。这种复杂性表明NLRP12可能作为一个精细调节的免疫节点发挥作用。

与NLRP12不同，NLRP3炎性小体在免疫中占据更核心的地位[8]。当感知到病毒RNA或其他危险信号时，NLRP3会招募适配蛋白ASC来激活caspase-1[9]。激活的caspase-1随后切割白细胞介素-1β（IL-1β）、IL-18和GSDMD的前体，产生多种在抗病毒反应中起关键作用的炎症介质。例如，IL-1β在人类髓系细胞、成纤维细胞和上皮细胞中促进线粒体DNA的释放，从而激活cGAS-STING通路并限制登革病毒感染[10]。IL-18诱导轮状病毒感染的肠上皮细胞死亡，直接破坏病毒复制周期[11]。在肠冠状病毒（如传染性胃肠炎病毒和猪德尔塔冠状病毒）感染期间，GSDMD介导的非经典型IFN-β分泌有助于抗病毒防御[12]。鉴于这些关键功能，NLRP3炎性小体已成为病毒破坏宿主免疫防御的主要靶标。

更有趣的是，硬骨鱼类在进化过程中NLR家族经历了显著扩展，产生了多个NLRP12的同源物（例如NLRP12样蛋白1、NLRP12样蛋白2）[13,14]。这种扩展可能与鱼类适应其复杂多变的水生环境所面临的免疫挑战有关[13]。这种基因扩展现象表明鱼类拥有更复杂和精细的炎症调节网络。然而，这些扩展的NLRP12样基因在调节宿主免疫反应和抗病毒防御中具体扮演了什么角色？NLRP12样蛋白2是否继承了其哺乳动物对应物的负调节功能，并通过抑制NLRP3炎性小体来影响GCRV感染？这一系列关键科学问题仍然是未探索的研究空白。

本研究旨在通过表征草鱼NLRP12样蛋白2的功能来填补这一知识空白。我们发现其过表达显著促进了GCRV的复制。机制上，NLRP12样蛋白2与ASC结合，从而阻碍了NLRP3炎性小体的正确组装。这进而抑制了caspase-1的激活以及IL-1β等细胞因子的成熟/分泌，最终削弱了宿主的抗病毒免疫反应。我们的研究不仅揭示了鱼类炎性小体通路中一个先前未被识别的负调节节点，还扩展了对鱼类免疫网络复杂性的理解。

实验部分

细胞培养、病毒扩增和滴度测定

CIK（Ctenopharyngodon idella肾脏）细胞在添加了10%胎牛血清（FBS）的最小必需培养基（MEM）中维持。草鱼呼肠孤病毒株GCRV-873在含有2% FBS的MEM中扩增于CIK细胞中。病毒滴度通过TCID₅₀测定法测定。简要来说，CIK细胞以每孔1 × 10⁵个细胞的密度接种在96孔板上。每个样本的六个重复孔分别接种了10倍系列稀释的病毒。经过1小时的吸附后

草鱼NLRP12样蛋白2的序列分析

草鱼NLRP12样蛋白2的开放阅读框（ORF）（GenBank登录号：ON012778）包含2727个核苷酸，编码一个909个氨基酸的蛋白质。序列和结构比对显示，草鱼NLRP12样蛋白2含有38个α螺旋和17个β链。草鱼NLRP12样蛋白2与其斑马鱼同源物（NLRP12样蛋白，NLRP12L）的序列一致性为69.2%，序列差异主要位于NLRP12样蛋白2基因的N端区域（图S1）。

使用

讨论

炎性小体是先天免疫的核心组成部分，在受到刺激时迅速组装以激活caspase-1并促进促炎细胞因子的成熟，从而在抗感染防御中发挥关键作用[19]。然而，其过度激活可能导致组织损伤，促使宿主进化出复杂的负调节机制以维持免疫平衡[20]。哺乳动物的NLRP12在免疫中扮演着矛盾的角色，因为它既可以抑制

资助

本研究得到了国家自然科学基金（32202979）和中国博士后科学基金（2021M693347）的支持。

利益冲突声明

作者声明与本研究、作者身份或文章发表无关的潜在利益冲突。