橙斑石斑鱼（Epinephelus coioides）中Rab11的功能特性及其对SGIV感染的响应

《Fish & Shellfish Immunology》：Functional characterization of the Rab11 and its response to SGIV infection in the orange-spotted grouper ( Epinephelus coioides)

本研究揭示橙色条纹鲈鱼 Rab11 同源物 EcRab11 通过调控宿主自噬和干扰素应答抑制新加坡组鲈鱼虹彩病毒（SGIV）感染，为开发抗病毒策略提供新依据。

　　

王立群|李海清|史彦杰|李伟聪|高文杰|吴德祺|王少文|秦启伟

广东海洋大学渔业学院，广东省水生动物疾病控制与健康养殖重点实验室，湛江，524088，中国

摘要

Rab11是Rab GTP酶家族的成员，作为囊泡运输的关键调节因子，并影响哺乳动物的病毒感染，然而其在水生病毒感染中的功能作用仍大部分尚未明确。新加坡石斑鱼虹彩病毒（SGIV）属于虹彩病毒科（Iridoviridae）的Ranavirus属，是危害石斑鱼养殖业的最重要病毒病原体之一。在本研究中，我们探讨了来自橙斑石斑鱼（Epinephelus coioides）的一种新型Rab11同源物（EcRab11）对SGIV感染的影响及其在宿主先天免疫反应中的作用。EcRab11与从哺乳动物到硬骨鱼类中的Rab11同源物具有高度相似的氨基酸序列，表明这种GTP酶在进化上具有保守性。在健康的石斑鱼中，EcRab11主要表达于肝脏和脾脏等主要免疫器官中，并且在免疫刺激后其转录水平显著升高。共聚焦成像显示EcRab11以独特的点状和囊泡状结构定位在细胞质中。相比之下，过表达一种持续活性的EcRab11突变体（CA-EcRab11，其在保守的Q70L位点具有GTP锁定突变，导致蛋白质持续激活且无法将GTP水解为GDP），会诱导形成较大的囊泡结构；而过表达一种显性负性EcRab11突变体（DN-EcRab11，其在保守的S25N位点具有GDP锁定突变，从而抑制GTP结合并使蛋白质处于非活性状态），则显著减少了囊泡的形成。共定位分析进一步表明EcRab11广泛分布于高尔基体、早期内体、晚期内体中，部分也分布于内质网或溶酶体中，但未与线粒体共定位。功能实验显示，EcRab11的过表达显著抑制了SGIV感染，而CA-EcRab11或DN-EcRab11的过表达则促进了病毒复制。此外，EcRab11还被发现能正向调节石斑鱼细胞中的自噬和IFN免疫反应。综上所述，我们的研究结果表明EcRab11通过调控宿主先天免疫反应来调节SGIV感染，揭示了Rab11对抗SGIV的新抗病毒机制，为石斑鱼养殖业的抗病毒策略开发提供了新的见解。

引言

Rab蛋白是一类重要的小GTP酶家族，包含30至70个成员，它们在不同生物体中协调囊泡运输、控制膜过程并维持细胞整体稳定性[1,2]。Rab蛋白的活性取决于其核苷酸结合状态：与GDP结合时处于非活性状态，与GTP结合时处于活性状态。鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEFs）通过促进GDP释放和GTP结合来激活Rab蛋白，而GTP酶激活蛋白（GAPs）则使其失活[3]。GEFs和GAPs共同构成了精确调控Rab蛋白活性的分子开关[4]。目前，某些Rab蛋白已被充分研究，并作为特定细胞区的标志物[5,6]。Rab5是早期内体的标志物，有助于将内吞囊泡定向到内体，促进早期内体之间的融合，协助多囊泡体的形成，并控制内体运动[7],[8],[9],[10],[11]。Rab7是晚期内体的标志物，在调节内体分选、溶酶体形成和吞噬过程中起关键作用[12]。除了这些被广泛研究的Rab蛋白外，一些新发现的Rab蛋白（如Rab11）的功能也在逐步得到研究[13]。Rab11定位于回收内体，这是将蛋白质和脂质运输到细胞膜的关键区室[14,15]。它在先天免疫中发挥重要作用，通过维持屏障完整性并引导TLR4等受体向吞噬体转移以吞噬病原体[16,17]。由于其广泛的分布和多样的功能，Rab11影响多种细胞过程，如吞噬作用、细胞迁移和自噬[18],[19],[20]。

Rab11也被认为是在多种动物病毒引起的感染中起关键作用的因素，包括马尔堡病毒（MARV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、肠道病毒71（EV-A71）、呼吸道合胞病毒（RSV）、日本脑炎病毒（JEV）和经典猪瘟病毒（CSFV）[21],[22],[23],[24],[25],[26]。MARV利用依赖于微管网络的Rab11介导的囊泡运输途径来释放病毒样颗粒和真正的病毒颗粒[21]。Rab11a作为病毒辅助因子支持PRRSV的复制，其作用与自噬过程相关[22]。在EV-A71感染中，Rab11a通过招募必要的伴侣蛋白来促进病毒形态形成[23]。RSV的核糖核蛋白复合物（vRNPs）利用Rab11依赖的微管运输进行细胞内运输[24]。此外，Rab11对于病毒的内吞作用至关重要，它介导了BHK-21细胞中对JEV的clathrin依赖性内吞作用以及猪肺泡巨噬细胞中对CSFV的caveola依赖性内吞作用[25,26]。目前大多数研究集中在Rab11与哺乳动物病毒的相互作用上，而其在对抗水生病毒免疫反应中的作用则很少被研究。

橙斑石斑鱼（Epinephelus coioides）是一种在中国和东南亚广泛养殖的重要海洋鱼类。近年来，病毒爆发给石斑鱼养殖业带来了重大经济损失[27,28]。其中，新加坡石斑鱼虹彩病毒（SGIV）是一种主要的病原体，导致高死亡率和高额经济损失[29,30]。研究表明，小GTP酶对于SGIV在石斑鱼中的成功感染和传播至关重要[31],[32],[33]。

为了深入了解Rab11在石斑鱼中的功能，我们从橙斑石斑鱼（Epinephelus coioides）中鉴定出一种新型小GTP酶EcRab11。通过对EcRab11进行全面的分析，研究了其表达模式、亚细胞定位以及在SGIV感染和宿主免疫反应中的作用，这些发现显著扩展了我们对Rab11在虹彩病毒致病性和石斑鱼先天免疫机制中的生物学功能的认识。

章节片段

鱼类、细胞和病毒

本研究中使用的橙斑石斑鱼（Epinephelus coioides）来自海南省的一个养鱼场。我们在实验室建立的石斑鱼脾脏（GS）细胞系在Leibovitz's L-15培养基（Gibco，美国）中培养，培养基中添加了10%的胎牛血清（Gibco，美国）[34]。SGIV和红斑石斑鱼神经坏死病毒（RGNNV）最初在实验室的GS细胞中分离并扩增。所有病毒株均保存在-80°C直至需要使用。

EcRab11的克隆和序列分析

EcRab11序列的特征

利用来自转录组数据（GenBank登录号：PZ013363）的EST序列，通过PCR扩增了石斑鱼Rab11（EcRab11）的开放阅读框（ORF）。所得到的215个氨基酸（aa）肽的预测分子量为24.34 kDa，理论pI值为5.71，预测不稳定（不稳定性指数为40.31）。序列同源性分析显示，其与Danio rerio的同源性为97.21%，与Homo sapiens的同源性为94.44%。氨基酸序列的对齐显示...

讨论

Rab GTP酶是细胞内囊泡运输的主要调节因子，它们介导囊泡出芽、运输、固定以及与目标区室的融合等关键步骤[39]。Rab11是一种多功能GTP酶，不仅维持先天免疫和病原体吞噬所需的受体向吞噬体的运输，还调节多种细胞过程[16],[17],[18],[19],[20]。然而，Rab11在鱼类中的具体功能仍不清楚。

作者声明

王立群：设计实验、分析数据并撰写手稿。李海清和史彦杰：提供材料和分析工具。李伟聪、高文杰和吴德祺：提供试剂和材料。王少文：讨论结果并审阅手稿草稿。秦启伟：监督研究并审阅手稿草稿。

资助

本研究得到了中国国家自然科学基金（42306100、42476088）、广东海洋大学科研启动基金（060302022503）、广州市科技项目（2025A04J4668）、广东省科技促进城乡区域协调发展专项（2025B0202010041）、广东省科技计划（2025B0202080001）等项目的支持。

致谢

我们感谢广东海洋大学的分析和测试中心在共聚焦显微镜使用方面的指导。