Sem1基因的破坏能增强酵母中的谷胱甘肽生成

《Food Bioscience》：Disruption of Sem1 enhances glutathione production in yeast

谷胱甘肽（GSH）是酵母中重要的抗氧化剂，本研究通过ARTP诱变结合全基因组测序，发现SEM1基因（编码26S蛋白酶体亚基）的突变可显著提升GSH产量，机制与ATP水平升高相关。

　　

严志波|赖晓宁|刘勇|赵新晴|秦玲|黄明涛

华南理工大学食品科学与工程学院，中国广州510641

摘要

谷胱甘肽（GSH）是生物体内最丰富的非蛋白质硫醇，广泛应用于食品、制药和化妆品行业。虽然基于酵母的GSH生产技术已经成熟，但优化菌株性能和提高生产效率仍是当前研究的热点。在本研究中，我们结合了常压和室温等离子体（ARTP）诱变技术以及全基因组测序方法，以鉴定能够增强Saccharomyces cerevisiae中GSH生物合成的新遗传靶点。研究发现，某些先前未被表征的突变在不同程度上提高了GSH的产生量。其中，编码26S蛋白酶体亚基的SEM1基因发生突变后，GSH产量显著增加，其完全缺失使产量比对照组提高了35.5%。机制分析表明，SEM1的功能丧失显著提升了细胞内ATP的水平，而ATP是GSH生物合成过程中的关键辅因子。这些发现揭示了蛋白酶体相关ATP消耗与GSH合成之间的新关联，为理解酵母中代谢物生物合成的能量耦合调控机制提供了新的见解。

引言

谷胱甘肽（γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸，GSH）是一种由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽。它是生物体内最丰富的低分子量非蛋白质硫醇，在维持细胞氧化还原平衡中起着核心作用（Kobayashi等人，2022年）。作为主要的细胞内抗氧化剂，GSH通过清除活性氧（ROS）来保护细胞免受氧化应激（Guan，2023年）。此外，GSH还参与外源物质解毒和免疫调节等生理过程（Gasmi等人，2024年）。由于其多功能性，GSH在食品、制药和化妆品行业具有广泛的应用。

随着商业需求的增加（Santos等人，2022年），提高GSH的生产效率成为当务之急。目前已探索了多种生产方法，包括溶剂提取、化学合成和微生物发酵（Chen等人，2020a年）。然而，前两种方法存在生产成本高、产量低和环境影响等问题，限制了其工业应用。相比之下，基于微生物的发酵方法更为可持续且可扩展。在微生物平台中，Saccharomyces cerevisiae因其生长迅速、遗传操作简便及安全性良好而成为生产GSH的首选宿主。值得注意的是，S. cerevisiae能自然积累高浓度的GSH，其含量可达干重（DCW）的0.1–1.0%（Penninckx，2002年），使其成为工业规模生物合成的理想选择。

随着GSH生物合成途径的阐明（Li等人，2004年），基于酵母的GSH发酵研究开始兴起。早期研究主要集中在优化发酵条件以增加细胞内GSH含量和生物量，从而提高总产量（Cha等人，2004年；Chen等人，2009年；Rollini & Manzoni，2006年；Santos等人，2007年；Wen等人，2006年）。然而，近年来代谢工程和合成生物学的进展使得人们开始关注菌株改良。许多研究表明，通过基因工程改造的S. cerevisiae菌株能够提高GSH产量（Jeon等人，2023年；Kobayashi等人，2019年；Kobayashi等人，2022年；Prima等人，2017年；Tang等人，2015年）。尽管取得了进展，实现高产GSH仍面临挑战。理性工程主要局限于已知生物合成途径的修改，许多重要的遗传或调控因素尚未被探索。鉴于GSH参与多种细胞过程，其合成与更广泛的代谢网络密切相关。这种复杂性表明，在S. cerevisiae中可能存在未被发现的基因靶点或调控模块，这些因素可能影响GSH的合成，但在以途径为中心的工程框架中往往被忽视。我们将这些间接或辅助的遗传因素称为“分支途径”，强调它们在核心生物合成途径之外的潜在作用。然而，迄今为止对这些分支途径的系统研究仍十分有限。

在本研究中，我们首先使用ARTP诱变技术提高酵母的GSH产量，随后通过全基因组测序鉴定由ARTP引入的突变，并通过反向代谢工程和发酵实验评估候选靶点的功能相关性，从而揭示了促进GSH生物合成的分支途径（图1）。通过这种方法，我们发现了一些与GSH合成密切相关的非传统基因。其中，26S蛋白酶体复合体的组分SEM1被证实是关键因素。SEM1突变株的细胞内ATP水平升高，表明26S蛋白酶体介导的泛素依赖性蛋白水解可能通过重新分配能量资源来促进GSH合成。本研究提出了一种通过鉴定新遗传靶点来调节酵母GSH合成的实用策略，为开发高效生产高能耗化合物的酵母细胞工厂提供了重要启示。

本研究使用的菌株、质粒和引物

细菌菌株E. coli DH5α用于常规克隆操作及质粒的维护和扩增。实验中使用的酵母菌株包括来自实验室库存的S. cerevisiae CEN.PK 113-5D（简称C113-5D）（Mans等人，2015年），以及从中国工业微生物菌种保藏中心（CICC，http://www.china-cicc.org/cicc/detail2/?sid=1596）购买的S. cerevisiae CICC 1447（遗传背景未知，简称C1447），两者均作为平行和迭代ARTP实验的亲本菌株。

两种亲本酵母菌株的比较

本研究旨在鉴定S. cerevisiae中影响GSH生物合成的未知基因靶点和调控元件。目前相关的全基因组研究还较为有限。为高效完成这一任务，我们使用了两种不同的S. cerevisiae菌株C113-5D和C1447，并分别对其进行多轮ARTP诱变。这种迭代进化策略旨在逐步产生具有改良特性的突变菌株系。

结论

本研究发现了影响S. cerevisiae中GSH生物合成的新遗传靶点。通过迭代ARTP诱变，我们获得了GSH产量逐步提高的酵母变体，并通过全基因组测序鉴定了进化过程中累积的突变。反向工程和发酵分析验证了多个增强GSH合成的新遗传靶点，其中26S蛋白酶体亚基SEM1尤为关键。

CRediT作者贡献声明

赖晓宁：撰写初稿、实验设计、方法学研究、数据分析、概念构建。严志波：撰写初稿、方法学研究、数据分析、概念构建。黄明涛：撰写修订稿、项目监督、数据分析、概念构建。秦玲：撰写修订稿、数据分析、数据整理、概念构建。赵新晴：撰写修订稿、数据分析。刘勇：实验研究

利益冲突声明

M.H.、Z.Y.和L.Q.已申请专利以保护与本研究相关的酵母菌株及其应用。若存在其他作者，他们声明没有可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

数据获取

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利益冲突声明

作者声明以下可能构成利益冲突的财务利益或个人关系：M.H.、Z.Y.和L.Q.已申请专利以保护与本研究相关的酵母菌株及其应用。若存在其他作者，他们声明没有可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（32471482）、中央高校基本科研业务费（2024ZYGXZR015）以及中国广州市科技计划（2024A04J3562）的支持。图形摘要和图1由BioRender.com制作。