通过表达OH-CATH30的Pichia pastoris产生的新型抗菌肽的研制：对病原体的效力及其作用机制的探究

《Food Bioscience》：Development of Novel Antimicrobial Peptides Produced by Pichia pastoris Expressing OH-CATH30: Efficacy and Mechanistic Insights Against Pathogens

本研究利用毕赤酵母表达OH-CATH30合成抗菌肽（AMP-yw），经酶解优化后证实其对弧菌抑制效果最佳（MIC=0.675 mg/mL），破坏生物膜及细胞结构，并通过筛选得到两个高活性小肽（P1:FSYYGK；P2:GPPGPTGAP），分子对接显示与靶菌结合能更低，为水产食品防腐提供新策略。

　　

张莉莉|王长娥|卢颖

上海海洋大学食品科学与技术学院，中国上海201306

摘要

抗菌肽（AMPs）在食品和农业领域显示出巨大的应用潜力。然而，其发展受到高生产成本和大规模制备困难的限制。毕赤酵母（Pichia pastoris）的异源表达系统具有大规模和低成本生产AMPs的潜力。在这里，我们从表达OH-CATH30的毕赤酵母发酵液中制备了一种AMP酶溶液（命名为：AMP-yw）。研究发现，1.25 mg/mL的AMP-yw对三种病原体（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌）的抑制作用比单宁酸更强。此外，AMP-yw对副溶血性弧菌的抑制效果最高（>70%），最低抑菌浓度（MIC）为0.675 mg/mL。机制研究表明，AMP-yw可以抑制生物膜的形成，破坏细胞壁和细胞膜，从而导致蛋白质和核酸泄漏，干扰能量代谢和脂质氧化，并抑制细菌生长。经过纯化、鉴定和筛选后，合成了两种小肽（P1：FSYYGK和P2：GPPGPTGAP）。这两种肽对副溶血性弧菌的抑制活性最强（>88%），与AMP-yw酶溶液的抑制效果一致。分子对接分析表明，这两种肽与副溶血性弧菌的结合能低于与大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的结合能，这可能解释了其对副溶血性弧菌具有高抑制活性的稳定结合基础。本研究证实了毕赤酵母OH-CATH30具有大规模生产AMPs的潜力，并为开发针对水生病原体的AMPs提供了一种新的策略。

引言

食源性病原菌发病率的增加已成为一个严重的全球公共卫生问题。Kim等人（2025年）指出，受污染的食物每年导致全球约6亿人患病，42万人死亡。通常，由细菌、寄生虫、病毒或化学物质引起的食源性疾病通过受污染的水和食物等媒介传播，导致人类感染和疾病。其中，微生物是中国食源性疾病爆发的主要因素（Li等人，2018年）。Liu等人（2022年）指出，2018年报告了291起食物中毒事件，导致7856例病例和98人死亡。这些事件和病例中，细菌性食物中毒分别占36.77%（107/291）和63.11%（4,958/7,856）。其中，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌等微生物已成为主要的食物致病菌（Chen等人，2024年）。

目前，针对水产品中食源性病原菌的抗菌策略主要分为传统方法（物理和化学方法）和新兴生物技术。物理方法包括低温保存、辐照处理和热处理等。例如，Melody等人（2008年）使用低温冰冻技术保存东方牡蛎（Crassostrea virginica），发现这种处理显著降低了创伤弧菌和副溶血性弧菌的水平。虽然物理保存方法可以减少化学残留物和食品性质的变化，但成本高昂且能耗大。化学方法主要涉及苯甲酸和山梨酸钾等防腐剂。例如，Chen等人（2013年）报告称，山梨酸钾能有效抑制去皮凡纳贝中的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长，并且可以在4°C下保存6天。尽管化学防腐剂的成本低且稳定性好，但长期使用会引发健康和安全问题。

因此，越来越多的消费者愿意接受使用天然和安全的新兴技术，如生物防腐剂（抗菌肽，AMPs）。由于其广谱抗菌活性、安全性、低残留和低耐药性，AMPs吸引了更多研究人员的关注。例如，Lv等人（2018年）从带鱼（Trichiurus lepturus）中分离出AMP DY4-2，其对鱼类病原菌和腐败菌（如荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、副溶血性弧菌、嗜血单核细胞增生李斯特菌）具有广谱抗菌活性。此外，在比目鱼片中添加DY4-2后，在4°C下12天内荧光假单胞菌的数量减少了2.7个对数单位，表明AMPs具有作为海鲜生物防腐剂的潜力。

此外，多项研究表明可以从多种蛇类（Naja atra、Bungarus fasciatus和Ophiophagus hannah）中分离出AMP。其中，从Ophiophagus hannah中分离出的OH-CATH30 AMP（34个氨基酸）表现出强抗菌活性，具有广谱抗菌特性，且其活性不受盐浓度的影响。此外，未观察到明显的溶血效应（Zhang等人，2010年）。Li等人（2012年）发现OH-CATH30对治疗小鼠中性粒细胞减少症和菌血症具有治疗效果，表明这种肽可能用于治疗由耐药细菌引起的全身性感染。进一步的研究表明，OH-CATH30可以选择性刺激先天免疫反应，防止败血症的发生（Li等人，2013年）。此外，它对由耐药铜绿假单胞菌引起的角膜炎也表现出良好的疗效（Li等人，2014年）。这些发现表明，OH-CATH30有望被开发成一种新型抗菌药物，用于对抗多重耐药细菌。然而，天然AMPs的产量低且提取困难，严重限制了AMPs的工业发展。近年来，许多研究通过毕赤酵母（P. pastoris）的重组表达成功获得了高产量的AMPs。例如，Liu等人（2023年）开发了一种表达OH-CATH30 AMP的毕赤酵母（X33）基因工程菌株，不仅降低了生产成本，还缩短了生产周期并提高了AMP的产量。Zhan等人（2020年）从1 L的毕赤酵母发酵培养物中获得了15 mg的重组PRW4（RFRRLRWKTRWRLKKI-NH2），纯度为90%，其对大肠杆菌 ATCC 25922、鼠伤寒沙门氏菌 C7731和金黄色葡萄球菌 ATCC 29213等细菌具有抗菌活性。因此，毕赤酵母的异源表达系统具有高效、低成本和可扩展生产的优势，成为提高AMP产量的方法之一。这种成本效益源于毕赤酵母能够利用高细胞密度发酵进行批量生产（Eskandari等人，2024年）。通过使用廉价的培养基（如矿物盐和甘油/甲醇），它以远低于化学合成的成本实现了高蛋白产量，使其在工业应用中非常可行。

本研究旨在建立一种从表达OH-CATH30 AMP的毕赤酵母发酵液中制备高抗菌活性AMP的方法（命名为yw），并研究其对食源性病原菌的抗菌特性和机制（图1）。首先，优化了一种具有高抗菌活性的AMP-yw酶解方法。接下来，使用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌作为模型细菌，评估了AMP-yw酶溶液对这三种病原体的抗菌性能。此外，通过分析生物膜的变化、生长曲线、细胞壁完整性、细胞膜通透性和细胞内代谢物，探讨了AMP-yw酶溶液的抗菌机制。基于凝胶过滤色谱、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）和生物信息学分析，筛选出了高效的小分子AMPs。最后，使用分子对接技术揭示了AMPs的活性位点。本研究为高效AMP在水产品中的成本效益开发以及毕赤酵母工程菌株的OH-CATH30发酵产品的应用提供了理论基础。

部分内容

化学物质和细菌菌株

毕赤酵母（P. pastoris）表达OH-CATH30的发酵液（命名为yw，< 600 Da）由江苏中阳集团有限公司（中国江苏）提供。大肠杆菌 ATCC 25922、金黄色葡萄球菌 CMCC(B) 26003和副溶血性弧菌 M6是在我们实验室（中国上海）内部分离和纯化的。Flavourzyme、中性蛋白酶、碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶购自Jinclon生物技术有限公司（中国北京）。胰酶和平板计数琼脂（PCA）以及Sephadex G-10购自Solarbio Science &

制备条件

为了从表达OH-CATH30的毕赤酵母发酵产物（命名为yw）中获得AMP酶溶液（命名为AMP-yw），使用大肠杆菌（1 × 10?8 CFU/mL）作为模型细菌，优化了五种不同的蛋白酶（中性蛋白酶、Flavourzyme、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶和胰酶）（图1A）。发现碱性蛋白酶的抑制区最大（17.25 ± 0.35 mm，图1B）。因此，我们选择了碱性蛋白酶进一步研究酶解时间、温度和酶添加量的影响

结论

本研究通过优化，使用表达OH-CATH30 AMP的毕赤酵母发酵液作为原料，建立了一种制备高抗菌活性AMP-yw的酶解方法。研究发现，AMP-yw对副溶血性弧菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用更强（MIC = 0.675 mg/mL），而对大肠杆菌的抑制作用较弱（MIC = 1.25 mg/mL）。值得注意的是，1.25 mg/mL的AMP-yw酶溶液对这三种病原体具有更强的抗菌效果

CRediT作者贡献声明

卢颖：撰写 – 审稿与编辑、监督、项目管理、资金获取。王长娥：验证、资源、方法学、研究。张莉莉：撰写 – 原稿撰写、可视化、软件应用、数据分析、概念化

未引用参考文献

Arasu和Al-Dhabi，2023年；Cooley和Lunte，2011年；Liu等人，2025年；Subedi等人，2025年。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

利益冲突声明

我们声明我们与其他个人或组织没有可能不恰当地影响我们工作的财务和个人关系，也没有任何性质或类型的职业或其他个人利益涉及任何产品、服务和/或公司，这些可能会影响本文所述内容或对该手稿的评审。

致谢

本工作得到了山东省重点研发计划（2023TZXD051）、病原体与生物安全国家重点实验室（军事医学科学院）（SKLPBS2252）以及CSPFTZ临港特殊区域海洋生物医学创新平台的科技资助。