《Food Bioscience》：Elucidating the molecular mechanism of pancreatic lipase inhibition by small molecules from
Auricularia auricula-judae via integrated biophysical approaches
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中乳铁蛋白异源表达系统构建及优化策略研究，通过毕赤酵母分泌途径优化，实现重组中乳铁蛋白产量达110 mg/L。
李颖|李珍|毛素阳|杜珊珊|李莎|徐红|雷鹏|邱一斌
南京工业大学食品科学与轻工业学院，中国南京211816
摘要
牛乳铁蛋白（BLF）是一种高价值的多功能蛋白质，以其铁结合能力和广谱抗菌特性而闻名。尽管它具有作为功能性食品成分的潜力，但由于天然来源中含量低且提取成本高，其工业应用受到限制。为了解决这一瓶颈，本研究首次成功地在被认定为安全（GRAS）的宿主Bacillus amyloliquefaciens中实现了重组BLF的分泌表达。最初，工程菌株的产量为18.0 ± 0.3 mg/L。为了提高分泌效率，采用了系统工程优化策略，包括优化核糖体结合位点（RBS）并融合了一种新型植酸酶衍生的信号肽（SPphy）以促进蛋白质的转运。关键的是，还共表达了分子伴侣PrsA以减轻折叠压力。这些改进使产量提高了6.1倍，在5升生物反应器中最终达到了110.0 ± 0.8 mg/L的产量。这项研究不仅证明了B. amyloliquefaciens作为BLF生产平台的可行性，还为其他复杂营养蛋白的异源生物制造提供了战略框架。
引言
牛乳铁蛋白（BLF）是一种属于转铁蛋白家族的非血红素铁结合蛋白（Cui等人，2022年；González-Chávez等人，2009年）。结构上，BLF由两个同源的叶状结构（N-叶和C-叶）通过一个灵活的α-螺旋连接而成，每个叶状结构都能与Fe3+及协同作用的阴离子可逆结合（Baker & Baker，2009年；Moore等人，1997年）。这种独特的铁螯合能力不仅提高了铁的生物利用度，还通过稳定游离铁来减轻胃肠道刺激（Berlov等人，2007年）。除了铁稳态调节外，BLF还具有广泛的生理活性，包括抗氧化、抗菌、免疫调节和益生元作用（Actor等人，2009年；Dyrda-Terniuk & Pomastowski，2023年；Wallace，2016年）。因此，BLF已成为功能性食品、婴儿配方奶粉和临床营养中的高价值成分。随着健康意识的提高，预计到2032年全球BLF市场将达到9.699亿美元（Ostrowska等人，2025年）。然而，目前的工业生产主要依赖于从牛奶或乳清中提取BLF。这种方法受到天然来源含量低、纯化成本高和环境影响大的限制（Hu等人，2024年）。这些供应方面的瓶颈迫切需要开发可持续、可扩展的生物技术替代方案。
合成生物学为BLF的精准发酵提供了有前景的方法，可以实现可控、高效且环境可持续的制造过程。然而，寻找最佳的表达宿主仍然是一个挑战。大肠杆菌作为重组蛋白合成的主要宿主之一，由于其复杂的遗传工具箱、易于培养的方案以及在大规模发酵过程中的经济可行性，一直是最早被研究的BLF表达平台之一。例如，Montoya等人将硫氧还蛋白（Trx）与全长牛乳铁蛋白融合并在大肠杆菌中表达，获得了15.3 mg/L的重组BLF产量，纯度为90.3%（García-Montoya等人，2013年）。然而，重组大肠杆菌产生的BLF通常以不溶性包涵体的形式存在，需要复杂的重折叠步骤。此外，革兰氏阴性细菌中的内毒素存在食品安全问题。因此，人们使用了其他细菌表达系统，如Rhodococcus erythropolis，通过逐步透析法成功获得了BLF的C-叶片段（W. S. Kim等人，2006年）。另外，Komagataella phaffii GS115菌株（以前称为Pichia pastoris）是最常用的真核生物表达宿主之一，使用pPIC9K载体并采用密码子优化和基因剂量调整等策略，最终实现了高达824.93 mg/L的BLF产量（Zhang等人，2025年）。然而，这一过程通常需要7-9天，且相对复杂，目标蛋白的细胞内积累会限制产量并增加纯化难度。因此，迫切需要一种具有安全（GRAS）状态的微生物宿主，能够高效分泌生物活性BLF并缩短发酵时间。Bacillus amyloliquefaciens是一种具有GRAS状态的革兰氏阳性细菌，由于其快速生长、食品安全性和强大的分泌能力，成为功能性蛋白生产的理想候选者（Luo等人，2023年）。目前，基于B. amyloliquefaciens的新型表达细胞工厂已成功用于多种酶的生物合成，包括α-淀粉酶（Li等人，2025年）、蛋白酶（Jiang等人，2022年）和纤维素酶（Bhatt等人，2024年）。通过机器学习模型预测和设计新型信号肽显著提高了该细胞工厂中重组蛋白的分泌效率（Li等人，2025年）。为了评估这种新型B. amyloliquefaciens宿主菌株合成BLF的潜力，我们实施了一系列系统优化策略，包括筛选最佳分泌表达宿主、设计重组表达元件以及优化BLF的翻译、分泌和折叠过程。这些措施旨在解决重组BLF在微生物表达宿主中面临的关键问题，如溶解度低、分泌效率低和产量不足。最终，我们建立了一条高效的可用于直接从食品级原料生产BLF的生物技术路线。这种方法为当前的动物源供应链提供了可行的替代方案，并为BLF的发酵生产提供了实际解决方案。
部分摘录
细菌菌株、质粒和化学品
大肠杆菌 DH5α（Invitrogen，中国上海）用于基因克隆和质粒构建，而大肠杆菌 GM2163用于质粒去甲基化。枯草芽孢杆菌 168和B. amyloliquefaciens SE被用作表达宿主。编码牛乳铁蛋白（BLF；NCBI登录号JX294418.1）的基因经过密码子优化，并由General Biosystems（中国滁州）化学合成。3-植酸酶基因（phy）是从B. amyloliquefaciens SE的基因组DNA中扩增获得的
重组BLF表达宿主的筛选与评估
芽孢杆菌属细菌具有强大的天然分泌机制，包含专门的信号肽和伴侣蛋白，有助于蛋白质直接转运到细胞外环境。这种分泌能力简化了后续纯化过程，并通常促进蛋白质的正确折叠（Yang等人，2021年）。为了选择最佳宿主，使用含有AmyE的IPTG诱导pHT43载体评估了两种食品级菌株枯草芽孢杆菌 168和B. amyloliquefaciens SE
结论
目前，BLF的微生物合成面临诸多挑战，包括表达产量低、生产成本高和生物活性不稳定。因此，开发最佳表达宿主是BLF生物技术研究的核心重点。为了解决这些问题，采用系统工程方法将B. amyloliquefaciens发展为BLF生产的宿主。该策略包括筛选功能性
CRediT作者贡献声明
杜珊珊：撰写、审稿与编辑、项目管理。李莎：监督、资金获取、概念构思。毛素阳：方法学设计、实验研究、数据管理。邱一斌：监督、资金获取、概念构思。徐红：撰写、审稿与编辑、项目管理。雷鹏：监督、资金获取、概念构思。李颖：撰写、原始草稿、软件开发、方法学设计、实验研究、数据管理、概念构思。李珍：软件开发
未引用参考文献
Genoud等人，1999年；Masson和Heremans，1971年；Montreuil等人，1960年；Wang等人，2025年；Zhang等人，2025年。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了国家重点研发计划（2023YFF1103400）和江苏省合成生物学基础研究中心（编号BK20233003）的支持。
