一种基于无标签G-四链结构的比色和荧光适配体传感器，用于准确检测单核细胞增生李斯特菌（Listeria Monocytogenes）

《Food Bioscience》：A label-free G-quadruplex based colorimetric and fluorescent aptasensor for accurate detection of Listeria Monocytogenes

李斯特菌快速检测方法：基于ZIF-90载体的无标记G-四联体aptasensor实现颜色/荧光双重信号，检测限10 CFU/mL，线性范围广，在牛奶和生菜中验证回收率94.4%-101.2%。

　　

洪旭|段梦霞|吴世佳|段诺

江南大学食品科学与资源国家重点实验室，中国无锡214122

摘要

单核细胞增生李斯特菌作为一种典型的食源性病原体，容易污染多种食品，对食品安全和全球公共卫生构成严重威胁。因此，开发灵敏且精确的单核细胞增生李斯特菌检测方法至关重要。在本研究中，建立了一种基于G-四链结构的无标记比色和荧光适配体传感器，用于准确检测单核细胞增生李斯特菌。多孔ZIF-90材料被用作载体，用于封装血红素和硫黄素T（ThT）信号分子，并涂覆锑（Sb）纳米颗粒（Sb@ZIF-90@hemin@ThT）。随后，通过静电相互作用将特异性针对单核细胞增生李斯特菌的适配体加载到复合材料中，以进一步密封信号分子。当适配体与单核细胞增生李斯特菌结合时，G-四链适配体从复合材料表面分离，释放出血红素和ThT，这些分子进一步插入四链结构中。生成的G-四链/血红素将TMB催化为蓝色氧化TMB，而G-四链/ThT则增强了荧光强度。优化后的系统显示出从10到10⁶ CFU/mL的宽线性检测范围，检测限（LOD）为10 CFU/mL。该平台成功应用于牛奶和生菜样本，回收率在94.4%到101.2%之间，显示出在食品和环境样本中准确检测单核细胞增生李斯特菌的强大潜力。

引言

单核细胞增生李斯特菌是一种革兰氏阳性兼性厌氧菌，具有显著的适应性，能够在各种恶劣环境中生存，包括低温、高氯化钠浓度和低pH值（Da Silva & De Martinis, 2013）。这种病原体的污染范围广泛，涉及多种食品基质，如乳制品（例如酸奶、奶酪）、畜禽肉类（例如新鲜肉、火腿、熏肉、禽类产品）、水产品（海鲜）和蔬菜。人类摄入含有单核细胞增生李斯特菌的食品可能导致李斯特菌病，常见临床症状包括肌肉疼痛、发热、恶心、呕吐和腹泻（Eallonardo & Freitag, 2023）。在严重情况下，病情可能发展为侵袭性感染，如败血症和脑膜炎。受感染的孕妇还可能经历早产、死产或流产，对公共卫生构成重大威胁（Duan et al., 2018; Chen et al., 2024）。

目前，单核细胞增生李斯特菌的检测方法包括平板菌落计数、分子生物学检测和免疫测定方法。虽然传统的平板计数方法准确性高，但其漫长的检测周期（通常超过7天）和繁琐的操作程序使其不适合快速检测需求（Jadhav et al., 2018; Vidovic et al., 2024）。分子生物学方法，如聚合酶链反应、定量聚合酶链反应、环介导等温扩增和基于核酸序列的扩增，可以显著缩短单核细胞增生李斯特菌的检测时间。然而，这些方法依赖于专用仪器、训练有素的操作人员以及严格的样品预处理，限制了其在现场快速检测中的应用（Law et al., 2015）。免疫测定方法灵敏且高效，但对抗体制备有严格要求，并且容易受到其他杂菌的干扰（Osek et al., 2022）。

基于适配体的生物传感器，即适配体传感器，因其高特异性、强稳定性和易于合成以及低免疫原性而受到广泛关注（Guo et al., 2021）。它已广泛应用于食品安全检测、临床诊断和环境监测等领域（Sun et al., 2025）。Du等人（2024）开发了一种基于适配体特异性捕获和金纳米颗粒催化活性的比色传感器，用于检测牛奶中的单核细胞增生李斯特菌。然而，这种依赖于单一信号输出的传感方法在面对复杂基质干扰时容易产生非特异性响应，从而影响检测结果的准确性。近年来，随着多功能纳米材料的进步，适配体传感器的检测信号输出已从单信号模式升级为多信号模式（Zhao et al., 2023）。例如，Yang等人（2025）构建了一种电化学发光/荧光双模式适配体传感器，用于检测大肠杆菌 O157:H7。改良后的适配体通过Ag-S键共价固定在HOF-101@AgNPs复合材料表面，形成标记的双信号传感探针。这种复合材料可以通过π→π*电子跃迁产生荧光信号，并与TPrA发生氧化还原反应，产生电化学发光信号，从而实现双信号的协同输出。基于此构建的适配体传感器不仅具有宽线性范围和低检测限（LOD），还具有出色的选择性、重复性和稳定性，为食品安全检测提供了一种非常有前景的技术方法（Fu et al., 2025）。

尽管具有多信号交叉验证和强抗干扰能力等优点，基于多功能材料的双模式传感检测方法仍受到复杂材料制备过程和高成本的限制。此外，适配体需要经过修饰和标记，这不仅增加了实验操作的复杂性，还可能由于空间位阻效应影响适配体与目标之间的结合活性（Zou et al., 2025）。无标记传感技术避免了繁琐的标记程序，降低了实验成本，并最大程度地保留了生物分子的天然生物活性（Wang et al., 2025）。在无标记传感系统中，检测信号通常由适配体的构象变化触发，尤其是G-四链（G4）结构。这种构象可以通过信号分子转化为可量化的物理或化学信号，从而实现目标的定量检测。例如，Chen等人（2025）开发了一种基于血红素/G-四链DNA酶的比色传感器，该酶表现出类似过氧化物酶的活性，能催化TMB生成比色信号。Li等人（2024）报道了一种无标记荧光适配体，其中硫黄素T（ThT）插入G4结构以产生增强的荧光信号。

由于游离的血红素和ThT容易受到环境因素的影响，从而影响检测的准确性和稳定性。近年来，金属有机框架（MOF）材料因其可调孔径、大比表面积和高稳定性等优势而在检测和分析领域受到广泛关注（Fatah & Omer, 2025）。其中，ZIF-90作为沸石咪唑框架（ZIFs）材料的典型代表，是一种由锌离子和2-甲基咪唑配体通过配位键组装而成的三维多孔材料（Wang et al., 2024）。由于其丰富的孔结构和大的比表面积，它已成为封装客体分子的优秀纳米载体（Wang et al., 2022; Zheng et al., 2025）。例如，Zhang等人（2025）利用ZIF-90的多孔结构和自组装特性制备了hemin@ZIF-90纳米酶，并将其整合到生物传感平台中，用于高灵敏度检测鼠伤寒沙门氏菌。ZIF-90表现出高效的装载能力、结构稳定性，并能为血红素提供稳定的微环境，从而保护其免受外部因素对其催化活性的影响。

然而，同时将血红素和ThT与G-四链结合以制备无标记双模式检测食源性病原体的方法鲜有报道。本文构建了一种基于ZIF-90作为载体的比色/荧光双模式检测平台，用于检测单核细胞增生李斯特菌，通过ZIF-90封装血红素和ThT信号分子，并结合具有G4结构的适配体来产生信号变化。该方法不仅保留了适配体识别的高特异性和无标记操作的便利性，还实现了双信号的相互验证，有望为食品样本中单核细胞增生李斯特菌的快速、准确和现场检测提供一种新方法。

材料与仪器

醋酸锌二水合物（Zn(CH₃COO)2·2H₂O，≥ 99.0%，AR）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF，≥ 99.5%，AR）、2-甲酰基咪唑（2-IFA，≥ 97.0%，AR）、N-甲基吡咯烷酮（NMP，≥ 99.5%，AR）、3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB，≥ 99.0%，AR）、二甲基亚砜（DMSO，≥ 99.7%，AR）、锑粉、血红素（≥ 98.0%，AR）和ThT（≥ 95.0%，AR）均购自上海化工试剂有限公司。适配体（5’-ATCCATGGGGCGGAGATGAGGGGGGGGGGGGTACCCGGTTGAT-3’）对

基于G-四链结构的无标记比色和荧光适配体传感器原理

基于G-四链结构的无标记比色和荧光适配体传感器原理如图1所示。首先制备多孔ZIF-90材料，然后封装血红素和ThT信号分子。随后，通过范德华力、静电吸引和配位效应等多种界面相互作用，在ZIF-90@hemin@ThT表面涂覆Sb纳米颗粒

结论

本研究建立了一种基于G-四链结构的无标记适配体传感器，用于准确检测单核细胞增生李斯特菌，使用多孔ZIF-90材料作为载体封装血红素和ThT信号分子，并涂覆Sb纳米颗粒。得益于G-四链/血红素复合物的优异催化活性以及G-四链/ThT复合物的增强荧光信号，实现了比色和荧光的双模式检测平台。

CRediT作者贡献声明

洪旭：撰写——原始草稿、软件开发、方法论设计、实验研究、数据分析、概念构建。段诺：撰写——审稿与编辑、项目监督、资源协调、资金获取、概念构思。段梦霞：数据可视化、软件应用、方法论设计。吴世佳：实验验证

未引用参考文献

Ma et al., 2022.

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究部分得到了国家重点研发计划（2025YFD2100500）、国家自然科学基金（32272449）、江苏省基础研究计划（BK20240100）以及江苏省食品安全与质量控制协同创新中心的支持。