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本研究评估鱼油作为协同添加剂在DMSO基冷冻培养基中的效果，发现0.1%鱼油使鱼卵母细胞解冻存活率从63.52%提升至78.25%，同时维持线粒体完整性和膜电位，降低MDA水平并调节应激基因表达。异种移植模型显示移植效率提升36.67%，证实鱼油能有效缓解DMSO造成的膜损伤，为经济型生物材料冷冻保存提供新方案。
Jingting Yao | Yihan Liu | Hongyan Xu | Shengqi Su
中国西部种质资源创制综合科学中心（重庆）科学城与西南大学渔业学院，淡水鱼类繁殖与发育重点实验室；教育部，重庆水生生物科学重点实验室，402460，重庆
摘要
开发与食品兼容的冷冻保护策略对于水生生物材料的保存至关重要。本研究评估了食品级鱼油（FO）作为标准DMSO基冷冻保护介质中的协同添加剂的有效性。添加0.1%的FO后，鱼卵巢细胞的解冻后存活率从63.52%显著提高至78.25%（n = 6个生物重复实验）。超微结构和功能分析证实，FO处理有效维持了线粒体完整性（n = 3）和膜电位（n = 6）。此外，FO通过降低MDA水平并调节应激反应基因的表达（特别是下调hsp70和lamp3基因）来减轻氧化应激（n = 6）。关键的是，功能恢复体现在种群倍增时间缩短（206.71小时，n = 6）以及异种移植模型中的36.67%的植入效率（n = 3）。这些发现表明FO是一种强大的、与食品兼容的添加剂，可用于优化生物技术中的传统冷冻保护方案。
引言
冷冻保护是保护食品生物技术中遗传资源的一项关键技术，尤其是在可持续水产养殖中，长期保存鱼类配子和生殖组织对于全球粮食安全至关重要（Kang等人，2024；Muchlisin等人，2020）。这一目标与当前强调在更广泛的辅助生殖技术中保持生殖生物材料安全性和功能性的框架相一致（Yang等人，2025）。尽管二甲基亚砜（DMSO）被广泛用作从人类细胞系到水生种质的冷冻保护剂，但它存在固有的局限性，包括剂量依赖性的细胞毒性、表观遗传改变和不良的临床反应（Ding等人，2024；Hoyberghs等人，2021；Muchlisin等人，2020；Van Velthoven等人，2021；Westphal等人，2017）。目前无DMSO的冷冻保护策略在工业应用方面面临重大障碍，主要是由于专门技术（如微流控海藻糖系统和静态磁场发生器）的资本成本过高，以及这些技术在处理大规模种质库时的可扩展性有限（Modaresi等人，2024；Ziani等人，2025）。这些未解决的局限性凸显了迫切需要更经济且可行的冷冻保护剂，以确保在遗传资源保存过程中同时保持细胞活力和生物技术效用。
这些挑战需要从机制上深入了解有效的冷冻保护剂。对冷冻损伤的基本理解表明，冷冻会导致关键细胞器（包括膜、线粒体和内质网）的结构损伤，同时破坏能量代谢和氧化还原平衡（Cao等人，2022；Liu等人，2021；Mélanie等人，2020）。在鱼类和哺乳动物模型中的研究表明，冷冻保护和DMSO暴露会显著降低精子和卵细胞的不饱和脂肪酸含量，而这些脂肪酸对于维持细胞膜的流动性至关重要（Beirao等人，2012；Kim等人，2001；Marques等人，2018）。我们对DMSO冷冻保护组织的代谢组学分析发现，膜脂质稳态是一个关键干预目标，因为冷冻保护组织中特定地耗尽了二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸（图S1）。基于这种独特的脂质组特征，我们假设在DMSO基冷冻保护介质中添加富含这些特定脂质的鱼油可以协同作用，减轻溶剂介导的膜提取并恢复双层膜的流动性（Costa等人，2018；Halluin等人，2024）。这一策略旨在克服纯化单一脂肪酸补充剂通常存在的稳定性问题，通过提供一种复杂的、食品级的脂质基质来更接近模拟自然生理环境。然而，最近的研究指出，在PUFA补充策略中存在一个关键悖论：低剂量配方通过调节膜流动性有效增强冷冻保护，而高浓度则经常通过双烯丙基氢介导的脂质过氧化加剧细胞损伤（Bozkurt & Yavas，2021；Losano等人，2018）。此外，外源性PUFA补充的效果可能受到内源性细胞脂质组特性的影响。据推测，基础饱和脂肪酸含量高的细胞从PUFA的插入中获益更多，这能有效缓解相变并在低温条件下保持膜流动性（Vazquez & Roldan，1997）。相反，天然PUFA水平高的细胞可能更快达到脂质饱和阈值，此时额外补充反而会通过脂质过氧化增加氧化应激的敏感性。这种二分法强调了精确调节浓度以平衡结构稳定性和氧化风险的必要性。
鱼类卵巢组织是水生食品生物材料的关键代表模型，因为它含有对可持续水产养殖和全球粮食安全至关重要的生殖干细胞。此外，早期卵巢细胞独特的富含脂质的膜结构为评估基于脂质的冷冻保护剂提供了严格的生理环境，而其形态上的均匀性（不同于不规则的体细胞组织）有助于可重复地量化冷冻损伤机制（Qin等人，2025）。我们对六种具有商业价值的鱼类的全面评估表明，鱼油补充有效解决了纯化PUFA所固有的浓度和物种依赖性限制。鱼油一致提高了冷冻-解冻后卵巢细胞的存活率（图S2），而纯化的EPA/DHA的效果则因内源性脂肪酸组成而异。这种广泛的冷冻保护作用源于其协同的物理化学性质，表现为通过微乳液实现高效的膜整合以及高密度不饱和脂肪酸在冷冻保护介质平衡过程中的快速膜整合（Hashimoto等人，1999；Joardar & Chakraborty，2023；Onuki等人，2006）。由此产生的膜重构可能缓解了核心的冷冻损伤机制，包括胆固醇-磷脂比例的扭曲、冰核诱导的相变和细胞脱水的障碍（Chang & Zhao，2021；Giraud等人，2000），同时确保整个细胞质的一致保护（Villalobos等人，2025）。实证证据验证了这种以膜为中心的保护作用在各种生物系统中的有效性，从膳食鱼油增强Prochilodus lineatus胚胎的膜灵活性（Costa等人，2018）到直接富集PUFA以保持冷冻保存的哺乳动物精子的膜流动性（Souza等人，2021；Silva等人，2017）。尽管微量抗氧化剂可能提供辅助稳定作用，但PUFA介导的膜强化是主要机制，氧化风险通过浓度优化得到控制（Zhu等人，2025）。然而，关于鱼油在冷冻-解冻循环过程中介导的膜稳定的精确时空动态仍不够清楚，特别是在实时保护细胞器超结构、调节低温应力下的氧化级联以及冷冻保存生物材料的长期功能保留方面。阐明这些机制对于确立食品级鱼油作为标准化冷冻保护剂至关重要。
本研究探讨了鱼油介导的冷冻保护机制，重点关注其在冷冻应力下保护细胞器超微结构完整性、调节冷冻-解冻过程中的氧化级联以及维持冷冻保存系统中细胞功能的能力。使用添加了食品级鱼油的冷冻保护介质对Schizothorax prenanti的卵巢组织进行了系统评估。采用透射电子显微镜进行膜和线粒体结构的纳米级分析，通过脂质过氧化标志物和抗氧化酶活性定量评估氧化稳态，并通过细胞增殖和异种移植等实验验证其功能。这些研究证实鱼油是一种经济且食品安全的冷冻保护剂，能够实现功能性食品生物材料的可扩展保存。这些进展支持通过改进的生物库技术生产高价值食品活性成分和下一代食品安全计划，以利用海洋来源的生物材料。
部分摘录
生物材料
从中国四川的一个商业水产养殖场获得了12条2岁的雌性Ya鱼（Schizothorax prenanti），平均体重为885.48 ± 82.39克。根据组织学评估，选择了发育阶段II-III的卵巢。将鱼浸入0.01%（w/v）的MS-222（3-氨基苯甲酸甲磺酸酯，MedChemExpress，CAS编号886–86-2）中，并用碳酸氢钠（1:10 w/w）缓冲，然后用75%（v/v）的乙醇（Sangon）进行表面消毒
鱼油的浓度依赖性冷冻保护作用
在10% DMSO基冷冻保护介质中，鱼油（FO）补充剂在0.0001%–0.5%的浓度范围内表现出浓度依赖性的效果。最大存活率出现在0.1% FO时（78.25 ± 7.47%），与0.05% FO（75.12 ± 4.64%；p = 0.3300）、0.3% FO（72.65 ± 7.88%；p = 0.2013）和0.01% FO（71.73 ± 4.58%；p = 0.1264）相似，但显著高于0.001% FO（67.92 ± 4.83%；p = 0.0101）、0.0001% FO（64.22 ± 5.21%；p = 0.0014）、0.5% FO（63.92 ± 5.81%；p = 0.008）和对照组
鱼油通过PUFA稳定作用保护膜完整性
冷冻保护会对细胞膜造成多方面的损伤，包括渗透压应力引起的体积波动和冰重结晶，导致机械应力破坏脂质双层并影响通道蛋白功能（Noiles等人，1995；Ribeiro等人，2022；Whaley等人，2021）。我们的发现证实了这一机制，显示出存活率显著降低以及离子通道基因的上调
结论
本研究表明，食品级鱼油（FO）是一种有效的鱼卵巢组织冷冻保护剂，能有效缓解DMSO基冷冻保护介质和冷冻过程造成的损伤。0.1%浓度的FO补充显著提高了解冻后的存活率至78.25%，同时对质膜和线粒体提供了保护。通过显著降低MDA水平和恢复正常功能，证明了氧化应激的协同缓解
CRediT作者贡献声明
Jingting Yao：撰写——原始草稿，研究。Yihan Liu：方法学。Hongyan Xu：撰写——审阅与编辑，监督，资金获取，概念化。Shengqi Su：撰写——审阅与编辑，监督，项目管理，概念化。
未引用的参考文献
Chow-shi-yée, Grondin, Ouellet和Averill-Bates, 2020
da Fran?a等人，2021
Kumar, Fazio, Giannetto, Piccione和Parrino, 2024
Lyons和Fair, 2017
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了中国国家重点研发计划（项目编号2022YFD2400902）的支持。
