发现和筛选耐热特征肽，以实现加工食品中小麦过敏原的准确定量

小麦加工食品中高温稳定过敏原标志肽的发现与检测方法建立

　　

吕英军|于晓静|李赫|孙敬文|陈燕|张晓梅|文晓莎|罗迪贤|姬华|张宏伟

深圳大学第三附属医院医学实验室中心，中国深圳518001

摘要

小麦面筋是导致食物相关疾病（如小麦过敏和乳糜泻）的主要原因，但在加工食品中对其进行可靠定量仍然具有挑战性。为了解决这个问题，我们开发了一种数据独立获取（DIA）的蛋白质组学筛选方法，发现了QYEQQPVVPSK、LEGSDALSTR和VNVPLYR等耐热标志肽，这些肽可用于定量高分子量麦谷蛋白（HMW-G）和低分子量麦谷蛋白（LMW-G）。通过与其他谷物蛋白质组的BLAST分析验证了它们的特异性。基于这些肽，我们开发了一种UHPLC-MS/MS方法，在薯片和鱼糜中测得HMW-G的检测限（LOD）为0.081 mg/kg，LMW-G的检测限为0.049 mg/kg，定量限（LOQ）分别为0.4 mg/kg和0.244 mg/kg。这种方法代表了耐热麦谷蛋白肽的首次应用，已成功应用于复杂的加工产品，为过敏原检测提供了一种可靠的工具。

引言

小麦是全球主要的粮食作物，但也是导致食物相关疾病（包括小麦过敏和乳糜泻）的主要原因，影响了全球约2.9%的人口（FAO, 2024; Martre et al., 2024）。对于这些患者来说，严格遵循无麸质饮食（GFD）是唯一有效的治疗方法。国际标准要求无麸质食品中的麸质含量必须低于20 mg/kg（Iglesia, Kwan, Virkud, & Iweala, 2024）。然而，尤其是对于加工食品，可靠的合规性监测仍然是一个重大挑战。

这一挑战因现代食品制造中广泛使用热处理方法（如烘焙、油炸和煮沸）而加剧（Khashaba et al., 2025; Luparelli et al., 2025; Rodríguez, Bongianino, León, & Bustos, 2025; Zhang, Li, Nie, Yang, & Zhu, 2025）。这些过程会导致蛋白质变性、聚集和断裂，从而破坏ELISA抗体识别的表位，并降解传统用于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法的肽靶标（Cabanillas, 2019; De Graaf et al., 2024）。因此，基于传统质谱的方法可能会低估麸质含量，对易感个体构成严重的健康风险（Millet et al., 2021; Schuster, Huen, Weiss, & Scherf, 2024）。尽管LC-MS/MS因其特异性和能够监测多个靶标而成为一种优越的技术，但其准确性在加工食品中的应用严重依赖于所选标志肽的稳定性（Rasheed et al., 2025）。例如，Li等人使用16种商业食品筛选肽来检测芝麻过敏原，并最终选择了9种最佳肽作为商业食品中过敏原检测的生物标志物（Li et al., 2025）。Henrottin等人在研究巧克力过敏原时也表明，特征肽的热稳定性是LC-MS/MS准确定量的前提条件（Henrottin et al., 2023）。因此，过敏原检测的关键挑战已从仪器灵敏度转移到用于定量的分子标志物的热稳定性上。

目前的方法通常依赖于从未加工（天然）蛋白质中鉴定出的标志肽或仅通过计算机模拟标准选出的肽，但这些肽可能无法在工业加工过程中存活（Van Gils & Simrén, 2025; Xu et al., 2025）。例如，Henrottin等人在使用LVVDQQLAGR（HMW-G）、VFLQQCSPVAMPQSLAR（LMW-G）和NYLLQQCNPVSLVSSLVSMILPR（Gamma-Gliadin）等肽检测加工食品中的麸质过敏原时出现了假阴性结果。这表明，如果不对这些肽的热稳定性进行预先评估，可能会导致定量误差，从而削弱热处理产品的无麸质声明（Henrottin et al., 2019）。为了解决这个问题，我们假设系统地选择具有内在耐热性的标志肽将为建立一种能够准确测量加工食品中过敏原的可靠定量方法奠定基础。在这里，我们描述了一种靶向蛋白质组学策略，旨在系统地识别和验证两种主要小麦过敏原的耐热标志肽。该方法包括四个关键阶段：首先，通过模拟工业加工条件的热处理对小麦面团进行热处理实验；接着，使用数据独立获取（DIA）质谱技术定量分析小麦蛋白质组，并识别在热处理后稳定性增强或消化性提高的蛋白质；然后利用计算机模拟消化工具合理选择这些耐热蛋白质的候选肽，并通过严格的生物信息学评估（通过BLAST）确保其特异性，避免易降解或修饰的基序；最后，通过靶向超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）实证验证这些肽的稳定性、可检测性和适用性。

利用这种综合方法，我们成功鉴定了HMW-G的QYEQQPVVPSK和LEGSDALSTR以及LMW-G的VNVPLYR作为新的耐热标志肽。基于这些可靠的生物标志物，我们开发并验证了一种高灵敏度和准确的稳定同位素稀释UHPLC-MS/MS方法。该方法被严格应用于薯片和鱼糜等复杂商业基质中隐藏过敏原的定量，证明了其在确保食品安全和保护消费者健康方面的实际效用。

部分摘录

化学品和试剂

小麦种子（品种：新疆冬粮18、38、41、51、新疆粮201、603、607、1548）由新疆农业科学院提供。研究中使用的化学品和试剂包括：尿素（CH?N?O）、碳酸氢铵（NH?HCO?）、氯化钾（KCl）（中国国家医药集团化工试剂有限公司）、三（羟甲基）氨基甲烷（Tris, C?H??NO?）和碘乙酰胺（IAA, ICH?CONH?）（北京索利宝科技有限公司，中国）。

蛋白质提取方法的选择和热稳定性的评估

准确定量小麦过敏原依赖于高效提取麦谷蛋白。提取不足可能导致低估，从而对乳糜泻患者或非乳糜泻麸质敏感者构成重大健康风险。为了优化提取过程，我们首先使用UHPLC-MS/MS结合数据依赖获取（DDA）方法评估了五种提取方法。如表S1所示，虽然改良的Osborne方案获得了最多的蛋白质

结论

在这项研究中，我们通过识别和验证新的耐热标志肽，建立了热处理食品中小麦过敏原的准确定量框架。我们的主要贡献在于使用基于DIA的策略发现了HMW-G的QYEQQPVVPSK和LEGSDALSTR以及LMW-G的VNVPLYR，这些肽即使在严重的热处理条件下也保持稳定且高度可检测。

CRediT作者贡献声明

吕英军：撰写——原始草稿、验证、方法学、研究。于晓静：撰写——原始草稿、验证、资源准备。李赫：软件支持、正式分析。孙敬文：验证、资源准备。陈燕：撰写——审稿与编辑、监督、数据管理。张晓梅：验证、资源准备。文晓莎：验证、资源准备、方法学。罗迪贤：撰写——审稿与编辑、监督、数据管理。姬华：撰写——审稿与编辑、监督、数据管理。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文的研究工作。

致谢

作者感谢中国国家重点研发计划（2023YFA0915602）和青岛海关区科技计划（QK202101）的财政支持。作者衷心感谢新疆农业科学院作物研究所和王建民先生慷慨提供的小麦种质资源。