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骨形成肽生物合成策略研究开发出高纯度（98.17%±1.15%）GVSR肽，产量达4.96±0.17 mg/L，显著提升MC3T3-E1细胞ALP活性（117.68%±4.89%）和矿化水平（271.97%±23.05%），分子模拟显示其与Wnt3a-WLS复合物结合自由能-19.38 kcal/mol，Western blot验证COL1A1/RUNX2表达上调（均p<0.05），为骨质疏松功能性食品提供理论依据。
韩迪·尹（Handi Yin）|李万星（Wanxing Li）|刘远发（Yuanfa Liu）|郑赵军（Zhaojun Zheng）
江苏省江南大学食品科学与技术学院、国家功能食品工程技术研究中心、国家谷物发酵与食品生物制造工程技术研究中心、江苏省食品安全与质量控制协同创新中心下属的食品科学与资源国家重点实验室，中国江苏省无锡市蠡湖路1800号，214122
摘要
成骨肽，尤其是来源于食品的成骨肽，是治疗骨质疏松症的有希望的候选物质。然而，传统的提取方法总是受到效率低下和纯度不足的限制。在此，我们开发了一种高效的短肽生物合成策略，并验证了其成骨效应及其潜在机制。基于我们实验室先前建立的黑豆成骨寡肽数据库，合成了一个名为GVSR的四肽，产率为约4.96 ± 0.17 mg/L，纯度为98.17% ± 1.15%。实验表明，GVSR能够显著增强MC3T3-E1细胞的成骨活性。具体来说，在1 μmol/L的浓度下，GVSR可使MC3T3-E1细胞的碱性磷酸酶（ALP）活性提高117.68% ± 4.89%（p < 0.01），基质矿化水平提高271.97% ± 23.05%（p < 0.0001）。分子对接和分子动力学模拟结果显示，GVSR的成骨效应可能源于其与Wnt3a-WLS复合物界面的稳定且特异性的结合，结合自由能为-19.38 kcal/mol。Wnt3a蛋白与Wnt/β-连环蛋白信号通路的激活密切相关，其分泌严重依赖于WLS蛋白。Western blot分析进一步证实，GVSR可通过影响Wnt/β-连环蛋白信号通路相关的蛋白质表达来刺激关键的成骨标志物，如α-1型1胶原蛋白（COL1A1）和runt相关转录因子2（RUNX2）。具体而言，7天后，1 μmol/L的GVSR使COL1A1和RUNX2的表达量分别增加了159.27% ± 14.38%（p < 0.05）和181.89% ± 28.80%（p < 0.05）。本研究为使用GVSR作为功能性食品预防骨质疏松症提供了理论基础。
引言
骨质疏松症主要影响绝经后妇女和老年人，是一种由于骨稳态失衡引起的系统性疾病（Eastell等，2016；Salhotra等，2020）。随着人口老龄化加剧，骨质疏松症已成为医疗保健系统和社会面临的重要且日益严重的经济挑战（Liang等，2025；Zhu等，2023）。在细胞水平上，成骨细胞作为间充质干细胞的终末分化产物，在基质合成和矿化过程中起着关键作用（Thomas & Jaganathan，2022；Zhu等，2024）。成骨细胞的分化受到细胞外信号和内分泌信号的调控（Ponzetti & Rucci，2021）。像甲状旁腺激素类似物这样的骨形成促进剂在促进骨骼形成方面起着积极作用，但长期使用可能受到不良反应和依从性的限制（Anastasilakis等，2024；Khosla & Hopbauer，2017）。因此，人们对安全有效的成骨剂越来越感兴趣。
生物活性肽因其出色的生物相容性而成为干预骨质疏松症的有前景的方法（Guo等，2023）。目前，已从动物和植物蛋白水解物中鉴定出许多成骨肽。例如，来自罗非鱼鳞胶原蛋白（GPAGPHGPVG、APDPFRMY和TPERYY）和龟壳（AWLNH和PHDL）的成骨肽表现出刺激成骨细胞分化和矿化的能力（Huang等，2022；Oh等，2019）。Wnt/β-连环蛋白通路已被证实对骨骼形成起重要作用，为评估成骨肽提供了可行的方法（Duan & Bonewald，2016；Hu等，2024）。在我们之前的研究中，我们发现黑豆来源的成骨肽对骨质疏松症管理具有潜在益处（Wang等，2020），这些肽可以增加MC3T3-E1细胞的增殖、分化和矿化，例如GVSR、KGVG和SIKL（Zhang等，2025）。
生物合成技术为生产序列定义的肽提供了一种互补且可扩展的方法，克服了酶水解和化学合成在环境影响和成本效益方面的局限性（Guo等，2024；Wang等，2022）。大肠杆菌（E. coli）作为表达宿主的流行性源于其遗传易操作性、高生产力和低成本（Incir & Kaplan，2024；Pontrelli等，2018）。然而，由于分子量较低，生物活性肽的表达量较低且容易受到蛋白酶降解的影响（Li等，2015）。目前，生物活性肽通常通过串联蛋白进行表达（Zhao等，2024）。例如，已在E. coli中成功制备了高纯度的十拷贝黄嘌呤氧化酶抑制肽（Mao等，2024）。值得注意的是，串联蛋白通常以包涵体的形式存在（Kitamura等，1999）。分子生物学技术的进步使研究人员能够进行新的生物活性肽融合表达，例如小泛素样修饰因子（SUMO）和麦芽糖结合蛋白（MBP），从而促进可溶性蛋白的生产（Zhang等，2024；Zhou等，2022；Zhang等，2022）。其中，带有SUMO标签的可溶性融合蛋白的产量提高了约8.5倍（Liu等，2013）。尽管取得了这些进展，但对于成骨肽而言，将串联结构与增溶标签合理整合的研究仍不够充分。
在我们之前的研究中，我们从黑豆中鉴定出一种新的四肽Gly-Val-Ser-Arg（GVSR）（Zhang等，2025）。为了高效制备GVSR，我们利用串联结构和增溶标签在E. coli中实现了异源表达，获得了可溶性的SUMO-GVSR10，并通过酶消化和纯化释放出GVSR。我们进一步通过研究其对MC3T3-E1细胞分化和矿化过程的影响来评估GVSR的成骨活性。此外，通过分子对接和分子动力学模拟模拟了GVSR在Wnt/β-连环蛋白信号通路中的潜在相互作用，并通过Western blot分析验证了这些发现。这项工作提供了一种环保且成本低廉的方法，用于大规模生产序列定义的肽，同时保持其生物活性。这些发现为后续的验证和在骨骼健康应用中的转化开发提供了实际基础。
材料
E. coli菌株购自中国上海的Biotechnology Engineering Services Co. Ltd。胰蛋白酶购自中国北京的Solarbio Science & Technology Co., Ltd。酵母提取物、蛋白胨、胎牛血清（FBS）和α-MEM购自美国卡尔斯巴德的Thermo Fisher Scientific。青霉素-链霉素溶液由中国苏州的Haixing Biosciences提供。β-甘油磷酸盐和L-抗坏血酸购自美国圣路易斯的Sigma-Aldrich。
四肽GVSR的制备
鉴于直接在E. coli中表达寡肽的难度，我们采用串联结构和增溶标签来制备GVSR四肽。通过菌落PCR验证了成功的转化体，得到了预期的513 bp片段（图2A）。SDS-PAGE分析显示诱导裂解物中有一个约19.40 kDa的明显条带，而对照组中不存在该条带，这与SUMO-GVSR10一致（图2B）。随后进行了亲和层析
结论
在本研究中，通过pET28a (+)-SUMO-GVSR10质粒在E. coli Rosetta（DE3）中实现了SUMO-GVSR10的表达，随后通过胰蛋白酶消化释放出GVSR。GVSR的产率为约4.96 ± 0.17 mg/L，纯度为98.17% ± 1.15%。GVSR显著增强了MC3T3-E1细胞的成骨活性，在1 μmol/L的浓度下，其在分化和矿化阶段的改善最为显著。
CRediT作者贡献声明
韩迪·尹：撰写——原始草稿、可视化、验证、研究、概念化。
李万星：撰写——审阅与编辑、监督、软件使用、方法学、研究。
刘远发：监督、资源管理、项目管理、方法学、正式分析。
郑赵军：监督、项目管理、方法学、资金获取、数据管理。
资助
本工作得到了江苏省杰出青年科学基金（BK20230105）、国家自然科学基金（32272246）以及江南大学食品科学与资源国家重点实验室研究计划（编号SKLF-ZZA-202509）的支持。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。
