《Nature Structural & Molecular Biology》：Chromatin spatial analysis by METALoci unveils sex-determining 3D regulatory hubs
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为解决哺乳动物性决定的表观遗传调控机制尚不明确的问题，研究人员通过荧光激活细胞分选、低细胞数Hi-C（染色体构象捕获）、ChIP-seq、转基因小鼠模型及新开发的计算工具METALoci（通过空间自相关分析识别三维调控枢纽），对小鼠胚胎性腺支持细胞系在性决定前后的三维染色质景观进行了系统研究。结果发现，尽管拓扑关联结构域（TADs）基本稳定，但大量的三维（3D）调控枢纽在性决定过程中发生了性别特异性和时间特异性的显著重构。通过该方法，研究人员成功鉴定并验证了雄性决定基因Fgf9下游的一个非编码调控区域，其缺失导致小鼠XY个体发生雄性向雌性性反转。此外，通过重建基因调控网络，发现了转录因子Meis基因家族在特异性腺发育中的冗余调节功能。这项研究强调了三维基因组在性决定中的动态作用，为理解发育过程的调控提供了新的视角和工具，并为人类性发育异常的诊断开辟了新途径。
哺乳动物性别的决定，是一场关乎生命的起源与多样性的精妙“抉择”。在胚胎发育的早期，本具有双向分化潜能的性腺，在接收到特定的信号后，将“选择”分化为睾丸或卵巢，进而决定了生物个体的生理性别。这一过程依赖于一系列“促睾丸”与“促卵巢”基因网络的精密平衡。尽管数十年研究已揭示了Sry、Sox9、Fgf9、Foxl2、Runx1等关键基因，但科学家们对这套“生命开关”背后的“布线图”——即三维染色质空间结构如何动态变化以调控这些基因的表达——仍知之甚少。理解这个“布线图”的奥秘，对于阐明性决定的根本机制，以及诊断和治疗性发育异常（DSDs）等临床问题至关重要。
为了填补这一知识空白，一个研究团队在《Nature Structural & Molecular Biology》上发表了一项开创性研究，他们首次在体内系统描绘了哺乳动物性决定过程中的三维染色质调控景观，并揭示了一个动态且复杂的“调控枢纽”重排过程。
研究人员运用了几个关键技术方法来解析这一复杂过程。首先，他们利用表达特定荧光蛋白的转基因小鼠品系，通过荧光激活细胞分选（FACS）技术，高纯度地分离了小鼠胚胎性腺中处于性决定前（E10.5天）双向潜能期，以及性决定后（E13.5天）分化为睾丸支持细胞（Sertoli细胞）或卵巢颗粒细胞（Granulosa cell）的细胞群体。其次，针对这些珍贵的少量细胞，他们采用了低细胞数Hi-C技术，构建了高分辨率的三维基因组互作图谱，并结合了H3K27ac（组蛋白H3第27位赖氨酸乙酰化修饰，活跃染色质标记）的ChIP-seq（染色质免疫共沉淀测序）数据。最后，为了从海量数据中提炼生物学洞见，他们开发并应用了一种名为METALoci的新型计算工具。该工具基于空间自相关分析，能够无偏地识别基因组范围内的三维调控枢纽，为探索染色质结构与功能的关系提供了新视角。
研究结果揭示了以下核心发现：
三维染色质结构在性决定过程中变化相对缓和
通过分析Hi-C数据，研究人员发现，染色质的区室化（A/B compartments）和拓扑关联结构域（TADs）在性决定过程中整体保持稳定，尤其是在TAD层面变化非常小，暗示了性腺细胞分化所需的大尺度染色质“骨架”在分化前已基本构建完成。
三维调控枢纽在时间和性别维度上发生显著重排
尽管大尺度结构稳定，但当整合Hi-C与H3K27ac数据，通过METALoci进行分析时，研究团队观察到了戏剧性的变化。大量基因的启动子及其周边的调控环境（即三维调控枢纽）在性决定过程中发生了显著的重构。这种重构具有明确的时间特异性和性别特异性。例如，著名的雄性决定基因Sox9的启动子，在分化前的XY细胞中处于不活跃状态，而在分化后的睾丸支持细胞中，它与已知的增强子（如TESCO和Enh13）共同形成了一个活跃的三维调控枢纽。类似地，许多与性腺发育相关的基因都经历了其调控枢纽的动态“开关”或状态转换。分析表明，雄性分化程序伴随的调控变化比雌性程序更为显著。
鉴定Fgf9基因的一个关键下游非编码调控区
研究人员利用METALoci作为预测工具，扫描了重要的雄性决定基因Fgf9的基因座。分析预测在其转录起始位点下游约250千碱基对（kb）处存在一个对维持其活跃调控枢纽至关重要的非编码区域。为了验证此预测，他们构建了携带该区域缺失（Δ306）的转基因小鼠。令人惊讶的是，尽管这个区域不包含任何已知基因，其缺失却导致了XY小鼠胚胎发生雄性向雌性的性反转，表现为卵睾体（卵巢和睾丸组织并存）或卵巢样性腺。对Fgf9表达的检测证实其显著下调。进一步构建两个更小范围的缺失（Δ93和Δ104）小鼠模型发现，调控功能分布于该区域内，存在一定的冗余性。尤为重要的是，与完全敲除Fgf9基因导致围产期死亡（由于肺发育不全）不同，Δ306突变体小鼠能够存活至出生后，表明这个调控区域具有组织特异性，成功地将Fgf9在性腺和肺中的功能“解耦”。
基因调控网络分析揭示Meis基因在性身份指定中的冗余功能
通过整合METALoci识别的候选调控区域与已发表的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据，研究人员重建了性腺支持细胞分化过程中的基因调控网络。网络分析将已知的性决定转录因子（如Sox9、Runx1、Foxl2）识别为顶级调控模块，同时也发现了一些新的候选因子，其中包括转录因子Meis1和Meis2。功能验证实验显示，单独敲除Meis1或同时缺失两个Meis等位基因（Meis1和Meis2各一个）的XY小鼠胚胎中，部分性腺支持细胞错误地分化为表达FOXL2的颗粒细胞。当三个Meis等位基因被同时敲除时，这种“性反转”现象更加严重和广泛。有趣的是，在XX小鼠中敲除三个Meis等位基因，也观察到了部分细胞表达SOX9的逆向性反转现象。这表明Meis1和Meis2基因在雌雄两性的性身份正确指定中均起着冗余且关键的作用。
研究结论与讨论强调了三维基因组在性决定中扮演的动态而重要的角色。研究表明，尽管维持基因组空间组织的大尺度结构（如TADs）相对稳定，但更精细尺度的三维调控枢纽却经历了广泛而深刻的重构，直接驱动了性别特异性基因表达程序的建立。这项工作具有多重重要意义：首先，它开发了METALoci这一强大的计算工具，能够从整合的多组学数据中无偏地识别功能相关的三维调控枢纽，为研究其他发育和疾病过程提供了新方法。其次，研究成功鉴定并验证了Fgf9基因的关键性腺特异性增强子区域，这不仅增进了对性决定分子机制的理解，其组织特异性特点也为未来可能的精准干预提供了思路。最后，通过系统性的网络分析发现了Meis基因等新的性决定调控因子，扩展了已知的性决定基因图谱。这些发现共同凸显了表观基因组学方法在揭示发育过程核心调控机制方面的巨大潜力，并将有助于提升对人类性发育异常的遗传诊断能力。
