《International Journal of Biological Macromolecules》：A highly efficient alkaline phosphatase for dephosphorylation of macromolecular substrates
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本研究成功表达酿酒酵母来源的碱性磷酸酶（sAP）在大肠杆菌中，发现其相比CIP具有更高的去磷酸化活性，适用于脂多糖（LPS）、磷酸化蛋白和DNA等大分子底物。rsAP在pH 7.0-11.0和65℃下表现优异稳定性，并能有效中和内毒素活性，改善小鼠内毒素休克模型生存率并降低TNF-α水平。结构分析表明其活性口袋深且亲脂，灵活性强，解释了高效催化机制。
谢宇|沈星宇|易增兴|刘毅|王佳宇|胡善通|张贵民
北京化工大学生命科学技术学院绿色生物制造国家重点实验室，北京，100029，中国
摘要
含磷酸基团的大分子对于细菌致病性和蛋白质翻译后修饰研究至关重要，但广泛使用的小牛肠碱性磷酸酶（CIP）在降解脂多糖（LPS）和蛋白质等复杂生物大分子时表现出较差的脱磷酸化活性。为了克服CIP对大分子底物的有限活性，我们成功地将来自酿酒酵母（S. cerevisiae）的碱性磷酸酶（sAP）表达在Komagataella phaffii中。重组sAP（rsAP）表达良好，在摇瓶发酵上清液中的蛋白产量达到1.12克/升。rsAP在广泛的pH范围（7.0–11.0）和高温（高达65°C）下表现出优异的催化活性和稳定性，最佳活性出现在pH 10.0和65°C时。值得注意的是，与CIP相比，rsAP对包括LPS、磷酸化蛋白质和线性DNA在内的大分子底物的脱磷酸化效率显著更高。重要的是，rsAP能够有效中和内毒素活性。在鼠内毒素血症模型中，用rsAP预处理LPS显著提高了存活率并降低了血清TNF-α水平。rsAP的优异性能归因于其独特的结构特征，包括一个深而疏水的活性口袋，具有互补的静电作用和增强的灵活性，而CIP则具有一个浅而亲水的、相对刚性的活性口袋，这可能阻碍其有效结合和处理大分子底物的能力。这项工作不仅突显了rsAP作为LPS解毒和磷酸蛋白修饰的强大生物催化剂的作用，还表明它具有多种生物技术和治疗应用的前景。
引言
碱性磷酸酶（APs，EC 3.1.3.1）是一类非特异性磷酸单酯酶，能够催化多种含磷酸基团底物的脱磷酸化，释放无机磷酸盐和相应的脱磷酸化产物[1]。这些酶通常以同二聚体形式存在，其催化活性通常需要Zn2+和Mg2+等金属离子。它们具有保守的活性位点结构，采用两步机制，涉及一个磷酸酶中间体[2]，[3]。除了在骨骼矿化、核苷酸代谢和信号转导等关键生理过程中发挥基础作用[4]，[5]外，APs已成为生物技术和分子生物学中不可或缺的工具。不可逆地去除磷酸基团使它们能够在多种关键领域得到应用，例如在DNA克隆中防止质粒自连接、生成用于后续标记的脱磷酸化载体[6]，[7]，[8]，以及在ELISA和化学发光测定中开发高灵敏度检测系统[9]，其中酶促反应直接与磷酸盐的释放相关。
迄今为止鉴定和应用的各种碱性磷酸酶中，小牛肠碱性磷酸酶（CIP）是实验室研究和工业中最常用的碱性磷酸酶之一，因为它在标准反应条件下的稳定性优异，并且有成熟且成本效益高的纯化方案[10]，[11]，[12]。其对小分子磷酸底物（如核苷单磷酸和p-硝基苯磷酸（pNPP）的高催化效率使其成为生化测定的主要工具[7]，[13]。
然而，尽管CIP应用广泛，但在处理大分子底物方面仍存在显著限制，而大分子底物在先进的生物技术应用中变得越来越重要[8]。例如，CIP在降解脂多糖（LPS，一种来自革兰氏阴性细菌外膜的内毒素）[14]，[15]和磷酸化蛋白质[16]时表现出较差的脱磷酸化活性。然而，含磷酸基团的大分子底物在细菌致病性[17]、基因治疗载体工程[18]和蛋白质翻译后修饰[19]等领域起着关键作用。例如，脂多糖（LPS）的磷酸基团是导致败血症和炎症性肠病的主要因素[15]，有效脱磷酸化LPS可以降低动物体内的促炎细胞因子（如TNF-α）水平，从而缓解败血症[20]，[21]。不幸的是，先前的研究和实践经验一致表明，CIP对这些大分子底物的脱磷酸化活性相对较低[8]，[22]。这一限制限制了依赖于有效处理含磷酸基团大分子底物的新型生物技术策略的探索。
虽然其他碱性磷酸酶，如大肠杆菌碱性磷酸酶（ECAP）[8]和人胎盘碱性磷酸酶（hPLAP）[23]，[24]，已经对其对小分子的底物活性有了很好的研究，但它们对LPS和完整磷酸蛋白等大分子底物的效率尚未得到研究。尽管λ蛋白磷酸酶（λ-PPase）对肽等磷酸蛋白表现出高活性[25]，但其对LPS或DNA的效率仍不清楚。此外，来自南极芽孢杆菌 P9的冷活性AP具有热不稳定性，目前仅针对小分子底物pNPP进行了评估[26]。尽管有各种可用的AP，但缺乏系统研究来评估它们对具有不同末端结构的大分子底物（特别是LPS和DNA）的效率。这一差距突显了开发一种结合广泛底物耐受性和高催化性能的酶的必要性。在这项研究中，我们从酿酒酵母中鉴定了一种碱性磷酸酶，并将其在K. phaffii中表达。以CIP作为对照，研究了纯化的rsAP对包括LPS、磷酸化蛋白质和线性DNA在内的大分子底物的活性。结果不仅证实了rsAP在这三种类型大分子底物上的优异脱磷酸化活性，还通过结构分析揭示了其高底物特异性机制，为先进的生物技术应用提供了新的酶工具。
菌株、培养基和试剂
使用大肠杆菌 Trelief? 5α（TransGen Biotech，中国）进行克隆和质粒构建。K. phaffii菌株X-33（在我们实验室保存）作为重组蛋白表达的宿主菌株。使用添加了25 μg/mL zeocin的低盐LB培养基进行细菌选择和质粒维持。使用添加了100 μg/mL zeocin的YPD培养基进行酵母选择。使用缓冲甘油复合培养基（BMGY）和缓冲甲醇复合培养基（BMMY）
sAP在K. phaffii中的表达
来自酿酒酵母的碱性磷酸酶（AP）编码基因被克隆到pPICZαA载体中，并转入K. phaffii X-33中。通过菌落PCR验证转化体，并在深孔板中筛选表达菌株。选择分泌表达水平最高的菌株在250毫升Erlenmeyer烧瓶中进行扩大培养。甲醇诱导后，每24小时收集一次培养上清液，并通过SDS-PAGE进行分析（图1A）。一个蛋白质条带
结论
在这项研究中，我们成功地将来自酿酒酵母的碱性磷酸酶表达在K. phaffii中，该酶在广泛的pH范围（7.0–11.0）和高温（高达65°C）下表现出强烈的催化活性和稳定性。更重要的是，与广泛使用的小牛肠碱性磷酸酶（CIP）相比，rsAP对包括脂多糖（LPS）、磷酸化蛋白质和线性DNA在内的大分子底物的脱磷酸化效率显著更高。
CRediT作者贡献声明
谢宇：撰写——原始草稿，验证，方法学，研究，正式分析，概念化。沈星宇：方法学，研究。易增兴：研究。刘毅：验证。王佳宇：撰写——原始草稿，正式分析。胡善通：正式分析。张贵民：撰写——审阅与编辑，监督，项目管理，资金获取，概念化。
机构审查委员会声明
这项动物研究已获得宜春大学医学伦理委员会的审查和批准。批准编号为XYXK2025-0043。
资助
这项工作得到了国家重点研发计划（2022YFC2105003）和北京自然科学基金（L244001）的支持。
利益冲突声明
作者声明没有利益冲突。资助方在研究的设计、执行、解释或撰写过程中没有发挥作用。
