《International Journal of Biological Macromolecules》：Milk protein-derived immunomodulatory peptides: Enzymatic preparation, sequence-function mapping, and antioxidant capacity with immune-related activities
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牛奶蛋白水解产物的免疫调节与抗氧化活性关联性研究。采用碱水解酶和胃蛋白酶-胰蛋白酶混合酶水解α-乳清蛋白、β-乳球蛋白和酪蛋白，通过LC-MS/MS和分子对接筛选出F2水解片段，发现GRFF、WDSF和SVPGPMGPSGPR三个肽可显著增强巨噬细胞吞噬能力及促炎因子分泌，同时具有高抗氧化活性（1.43-1.85 μmol TE/mg），机制涉及TLR2/4信号通路与Keap1抗氧化调节系统协同作用。
刘梦琪|邱英超|赵洪福|赵子英|张英华|穆志深
教育部乳品科学重点实验室，东北农业大学，哈尔滨，150030，中国
摘要
本研究通过使用碱性蛋白酶或胃蛋白酶-胰蛋白酶混合物水解三种牛奶蛋白（α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和酪蛋白）来生成多功能肽。通过LC-MS/MS对高活性水解物组分进行了表征，并利用分子对接技术揭示了其作用机制。研究发现，免疫调节活性与体外抗氧化能力之间存在显著相关性。在所有组分中，α-乳白蛋白碱性蛋白酶水解物中的F2组分表现出最高的体外抗氧化能力（2.0547 ± 0.0321 μmol TE/mg）。从F2组分中鉴定出的三种肽（GRFF、WDSF和SVPGPMGPSGPR）显著增强了RAW264.7细胞的吞噬作用，并促进了促炎因子的分泌，同时它们也具有显著的体外抗氧化能力（1.4320 ± 0.0140至1.8450 ± 0.0070 μmol TE/mg）。对接分析表明，这些肽可能通过与TLR2/TLR4及抗氧化调节因子Keap1的相互作用，介导免疫激活与氧化还原状态之间的关联。总体而言，本研究为发现和利用源自牛奶蛋白的高价值多功能生物活性肽提供了理论基础。
引言
牛奶蛋白含量丰富、营养价值高且易于加工，使其成为功能性食品和营养成分的理想原料。与完整蛋白质相比，可控的水解过程可以释放出原本被埋藏在天然结构中的生物活性片段，从而产生具有更好可利用性和潜在生物利用度的肽，进而提升其功能价值和应用前景[1]。目前，酶法水解在实验室和工业生产中得到广泛应用，因为该过程在温和条件下进行，且能够精确控制反应程度和产物组成[2]。
免疫调节依赖于免疫细胞和信号介质的协同作用以维持宿主防御[3]。近年来，源自牛奶的生物活性肽因其免疫调节和抗氧化潜力而受到广泛关注。研究表明，牛奶蛋白水解物及其衍生物肽可以通过影响巨噬细胞的吞噬活性及免疫介质（如一氧化氮NO和细胞因子）的产生来调节先天免疫反应。例如，酪蛋白衍生的肽PFPEVFG以及乳清蛋白水解物中的某些肽在体外表现出免疫调节活性，其作用机制通过分子对接等相关分析得到了验证[4][5]。此外，水解条件能够显著改变肽的化学结构，从而产生不同的体外抗氧化活性，表明某些牛奶肽可能直接清除活性氧，从而有助于维持氧化还原平衡[6]。
在炎症反应中，免疫激活与氧化应激密切相关。适量的活性氧（ROS）有助于杀灭微生物和细胞内信号传导，而过量的ROS则会引发氧化损伤并加剧炎症[7]。因此，目标不仅是抑制ROS，还要在保持免疫反应性的同时维持免疫和氧化还原平衡。尽管相关研究不断增多，但大多数研究仍局限于单一底物或单一水解方法，不同牛奶蛋白及水解策略之间的标准化比较仍较为有限。此外，免疫调节效果和抗氧化能力往往被独立评估，两者之间的关联及其潜在互补性尚未得到充分证实。
在本研究中，我们选择了三种代表性的牛奶蛋白（α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和酪蛋白）作为底物，并采用了两种互补的水解方法：以过程为导向的蛋白酶水解和模拟胃肠道消化。基于巨噬细胞免疫相关指标及体外抗氧化活性，我们筛选出了更优的水解方案，并探讨了免疫调节效果与抗氧化潜力之间的关联。通过肽组学分析、计算机模拟筛选、分子对接和肽合成等技术，我们鉴定并验证了具有免疫调节作用的关键肽。我们推测，底物结构和水解方法的差异会改变肽的组成，进而影响其免疫调节和抗氧化活性，这可能与免疫识别和氧化还原调节的关键机制有关。
材料与试剂
α-乳白蛋白（蛋白质含量85%，w/w）、β-乳球蛋白（蛋白质含量90%，w/w）和酪蛋白钠（蛋白质含量85.07%，w/w）购自Arla Foods Ingredients（丹麦）。β-巯基乙醇、邻苯二甲醛（OPA）、碱性蛋白酶（200,000 U/g）、胃蛋白酶（250 U/mg）和胰蛋白酶（250 U/mg）购自北京Solarbio科技有限公司（北京，中国）。胎牛血清（FBS）购自天航生物科技有限公司（浙江，中国）。
免疫调节肽的酶法制备
研究表明，含有疏水性氨基酸（Trp、Phe和Ala）、氨基酸侧链（Val、Ile和Leu）以及碱性氨基酸（Lys和Arg）的肽，或者N端或C端含有Arg、Ser、Gln或Trp的肽，能够显著增强免疫调节活性[15]。胃蛋白酶和胰蛋白酶是胃肠道消化过程中的两种酶，它们可以水解这些氨基酸，释放出芳香族氨基酸（Trp、Phe和Tyr）等活性物质。
结论
本研究证实，牛奶蛋白的酶解产物具有免疫调节和抗氧化双重活性。通过LC-MS/MS鉴定结合生物信息学分析，我们鉴定出了三种新的免疫调节肽候选物（GRFF、WDSF和SVPGPMGPSGPR）。体外实验表明，这些合成肽显著增强了RAW264.7细胞的吞噬作用，并促进了NO的产生及免疫相关因子（如IL-1β、IL-6）的分泌。
作者贡献声明
刘梦琪：撰写初稿，方法学设计。邱英超：数据分析与整理。赵洪福：软件应用。赵子英：数据分析。张英华：撰写、审稿与编辑，项目监督。穆志深：撰写、审稿与编辑，项目监督。
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了黑龙江省自然科学基金校企合作项目（JJ2025XQ0045）的资助。
