基于壳聚糖寡糖-聚乙烯亚胺包封的环状RNA（circRNA）的纳米疫苗，该环状RNA编码sigma C蛋白，能够在鸭子体内诱导针对新型鸭子呼肠孤病毒的防护性免疫反应

《International Journal of Biological Macromolecules》：Nanovaccine based on chitosan oligosaccharide-polyethyleneimine packaged circRNA encoding sigma C proteins elicits protective immunity against novel duck reovirus in ducks

circRNA疫苗通过CS-PEI纳米颗粒递送有效诱导鸭子的体液和细胞免疫应答，完全保护新型鸭瘟病毒（NDRV）挑战。研究建立circRNA表达平台，验证其在鸭胚成纤维细胞和HEK293T细胞中的转染效率，为禽类病毒性疫苗开发提供新策略。

　　

田斌|蔡倩迪|肖珍|蔡东杰|欧一平|王明书|贾仁勇|陈顺|朱德康|刘玛峰|吴英|姚阳|张莎秋|赵新新|孙迪|黄娟|欧旭敏|吴振|何宇|程安春

中华人民共和国教育部西南动物疾病预防与控制技术工程研究中心

摘要

mRNA疫苗的优势在于其设计灵活性和高效的免疫激活能力。作为下一代平台，环状RNA（circRNA）比线性mRNA具有更优异的分子稳定性和更低的免疫原性。然而，针对禽类病毒疾病的circRNA疫苗的可行性尚未得到探索。为了解决这一问题，我们设计了一种基于天然生物大分子壳聚糖寡糖与聚乙烯亚胺（CS-PEI）结合的circRNA纳米疫苗平台，并评估了其疗效和保护潜力。我们通过构建一系列质粒来设计这种circRNA表达平台，这些质粒编码报告基因（Nanoluciferase）或新型鸭子呼肠孤病毒（NDRV）的σC蛋白。纯化的circRNA通过转染试剂和CS-PEI成功转染到HEK293T细胞和鸭胚胎成纤维细胞（DEF）中，并通过Nanoluc luciferase检测、荧光成像和间接免疫荧光验证了外源蛋白的表达。将编码σC的circRNA（circRNA-σC）封装在直径约170纳米的纳米颗粒中，适用于雏鸭的接种。该CS-PEI-circRNA-σC疫苗的免疫原性和保护效果得到了全面评估。结果表明，该疫苗能够诱导强烈的体液免疫和细胞免疫反应，并对后续的NDRV攻击提供有效保护。这些发现为开发针对禽类病毒感染的下一代疫苗提供了基础框架和有价值的技术支持，也可能应用于其他病毒性疾病。

引言

mRNA疫苗的核心优势——设计灵活性、高效的免疫激活、安全性、快速开发以及多样的应用——使其成为现代疫苗学中的突破性技术[1]。然而，传统线性mRNA的广泛应用受到其短暂表达时间（功能寿命为1-3天）、固有的不稳定性和意外免疫原性的限制[2]。为了解决这些问题，环状RNA（circRNA）作为一种有前景的下一代平台应运而生。circRNA的共价闭合环状结构缺乏5′帽和3′多聚(A)尾，这使其具有抗外切核酸酶降解的优异稳定性[3]、[4]、[5]、[6]、[7]。这种增强的稳定性使得其在哺乳动物系统中的半衰期比线性mRNA长五倍以上[8]、[9]、[10]，从而能够持续产生更高水平的蛋白质。circRNA的翻译由内部核糖体进入位点（IRES）或m6A修饰驱动，实现无需5′帽的翻译[2]、[11]。由此产生的延长抗原表达时间（通常超过7天）模拟了自然感染中的长期抗原呈现，可能带来更强大和持久的免疫反应[12]。此外，缺乏5′帽结构有助于circRNA逃避模式识别受体（如RIG-I）的识别，从而减少先天免疫激活和炎症细胞因子的释放，相比线性mRNA[13]。这些优势推动了circRNA疫苗的快速发展。首个被证明有效的circRNA疫苗是表达SARS-CoV-2刺突蛋白三聚体的疫苗，它在小鼠和恒河猴中引发了强烈的中和抗体和T细胞反应[14]。随后，一种针对狂犬病病毒糖蛋白（G）的circRNA疫苗经过甘露糖-PEG脂质修饰，以实现向树突状细胞的靶向递送，促进淋巴结特异性分布和持续抗原释放[15]。另一种circRNA平台同时表达抗原和趋化因子CXCL13，后者作为佐剂增强了针对多种病毒糖蛋白的抗体反应的强度和广度[16]。多价疫苗，如三价circRNA流感疫苗，能够引发针对三种NA亚型的平衡抗体反应和Th1偏向的免疫反应，保护小鼠免受匹配和不匹配菌株的致命攻击[17]。类似地，二价和牛痘病毒（MPXV）组合疫苗也诱导了强烈的中和抗体和T细胞免疫，展示了该平台在复杂抗原方案中的实用性[18]、[19]。单剂量的寨卡病毒circRNA疫苗为新生小鼠提供了垂直保护，同时不会增强登革热病毒的病理效应，突显了其精细的安全性和有效性[20]。受这些进展的启发，circRNA技术为兽医医学提供了一种变革性的策略，特别是针对在禽类中传播的人畜共患病毒疾病。其优异的稳定性、强大的免疫原性和多价设计的灵活性为对抗新兴的禽类病毒威胁提供了强大的新工具。

然而，有效的RNA疫苗的开发依赖于安全高效的佐剂和递送系统。壳聚糖（CS）是一种天然的阳离子多糖生物大分子，由于其生物相容性、可生物降解性、黏附特性和易获取性，成为核酸递送的有希望的候选材料[21]、[22]。其质子化的氨基能够有效将核酸浓缩成稳定的纳米颗粒，防止核酸酶降解并延长在黏膜部位的停留时间。聚乙烯亚胺（PEI）另一种阳离子聚合物，具有高电荷密度，可通过静电作用将核酸压缩成纳米复合物。其“质子海绵”效应有助于内体逃逸，显著提高转染效率，并已被证明能有效递送包括mRNA在内的各种分子载荷[23]。CS和PEI的结合创建了一种协同递送系统。例如，将壳聚糖与PEI结合可以减轻PEI的细胞毒性，同时保持其优异的内体逃逸能力[24]。这种混合方法还显示出共同递送疫苗成分以激活多种免疫途径的巨大潜力[25]。迄今为止，这类CS-PEI组合通常使用高分子量成分（如100-400 kDa的壳聚糖与25-1.8 kDa的PEI结合）来递送DNA或siRNA[24]、[26]、[27]、[28]；它们在mRNA或环状RNA（circRNA）递送中的应用尚未得到探索。与脂质纳米颗粒（LNPs）相比，结合壳聚糖-PEI的系统在制备便利性、成本效益和材料可用性方面具有优势。禽类是许多人畜共患黄病毒的关键宿主或中间宿主，包括乌苏图病毒（USUV）、西尼罗河病毒（WNV）、蜱传脑炎病毒（TBEV）和日本脑炎病毒（JEV）[29]。这些病原体的全球传播，由于鸟类贸易和人类活动的影响，使得疫苗接种成为中断传播周期的关键策略。因此，CS-PEI在开发针对主要禽类病毒（如流感病毒（IV）、坦布苏病毒（TMUV）、鸭甲型肝炎病毒1型（DHAV-1）和新型鸭呼肠孤病毒（NDRV）的RNA疫苗方面具有巨大潜力。然而，结合壳聚糖-PEI是否能在禽类（特别是鸭子）中有效作为circRNA疫苗的递送载体，这一基本问题仍需进一步研究。

鸭出血性坏死性肝炎是一种高传染性疾病，具有显著的发病率和死亡率，对全球鸭养殖业构成严重威胁[30]。该疾病由新型鸭呼肠孤病毒（NDRV）引起。NDRV于2011年首次在北京鸭中被发现，是一种禽正呼肠孤病毒（ARV）的原型株，与经典的莫斯科鸭呼肠孤病毒（MDRV）相比具有不同的致病性和分子特征[31]、[32]、[33]。值得注意的是，NDRV的宿主范围更广，包括野生水禽、樱桃谷鸭、北京鸭和鹅，并且比MDRV引起更高的死亡率[34]、[35]、[36]、[37]。目前尚无针对NDRV的商业疫苗。正在研究的疫苗包括灭活疫苗、减毒活疫苗、自杀性DNA疫苗和亚单位疫苗[38]、[39]、[40]、[41]、[42]。每种平台都有其局限性：灭活疫苗安全但免疫原性较弱；减毒活疫苗能引发强烈免疫，但存在毒力恢复的风险[43]；亚单位疫苗（如基于σC和σB蛋白的疫苗）虽然安全，但免疫原性较弱且表位覆盖不完全；而病毒载体疫苗则受到基因重组、预先存在的免疫力和储存条件要求的限制[38]、[41]、[44]。因此，迫切需要开发新型、安全且有效的NDRV疫苗。NDRV是一种无包膜的双链RNA病毒，属于正呼肠孤病毒属（Reoviridae科）。其二十面体病毒颗粒直径约为70-80纳米，具有双层衣壳：外层衣壳由μB、σB和σC蛋白组成，内层核心主要由λB、μA和σA蛋白组成[45]。其中，σC蛋白是主要的结构成分，也是病毒进入的关键介质，直接促进受体结合和宿主细胞附着[41]。研究表明，σC是NDRV的主要免疫原性蛋白，能够有效刺激体液免疫（特异性IgY和中和抗体）和细胞免疫（Th1/Th2反应和CTL活性）。免疫后的抗体滴度与保护效果呈正相关[38]、[41]。基于σC的疫苗（如DNA和亚单位疫苗）可以在雏鸭体内早在免疫后7天就诱导长期的免疫记忆和高水平的抗体，使其成为早期接种的理想候选者[42]。

在这项研究中，我们设计了一种新型circRNA疫苗平台，以克服传统NDRV疫苗的不足。利用T4噬菌体I型内含子自剪接（PIE）系统，我们构建了一种包含鸭甲型肝炎病毒1型（DHAV-1）5′ UTR中的IRES元素的circRNA结构，以驱动NDRV σC抗原的翻译。这种circRNA被有效地封装在壳聚糖-聚乙烯亚胺（CS-PEI）纳米颗粒中，用于体外和体内递送。我们的结果表明，CS-PEI-circRNA-σC疫苗在接种的雏鸭中引发了强烈的体液和细胞免疫反应，并对后续的强毒NDRV攻击提供了完全保护。这项研究为NDRV的circRNA疫苗开发提供了一种通用且强大的策略，为下一代禽类疫苗的开发奠定了基础。

伦理声明

本研究获得了四川农业大学实验动物指南和动物福利委员会的批准。所有动物实验均严格遵循批准的指南进行（批准许可号SYXK 2019–187）。

抗体、病毒株、质粒构建体和试剂

本研究中使用的强毒NDRV-4株是由我们实验室分离和鉴定的。NDRV菌株的培养和50%组织培养感染剂量（TCID??）的测定

DHAV-1 IRES能够在鸭细胞中驱动circRNA的蛋白质表达

为了设计适合鸭子的纳米疫苗，我们首先根据pUC57骨架构建了一系列质粒，这些质粒基于之前描述的GTP催化下的自催化组I内含子策略（PIE系统）[6]。首先使用T7高产RNA转录试剂盒进行体外转录（IVT）生成线性RNA，然后通过GTP催化的PIE系统将其环化（见图1A）。随后进行RNase R处理以消化

讨论

环状RNA（circRNA）具有共价闭合结构，具有抗外切核酸酶的稳定性和比线性mRNA更高的稳定性[50]、[51]。它通过IRES/m6A修饰实现无需5′帽的翻译，延长了抗原表达时间并降低了疫苗生产成本（帽类似物占mRNA疫苗材料成本的约47%）。工程化的circRNA通过优化环化系统和高效的IRES筛选实现灵活性，而未经修饰的circRNA则表现出较低的

CRediT作者贡献声明

田斌：撰写——原始草稿，数据管理。蔡倩迪：撰写——原始草稿，数据管理。肖珍：软件，方法学。蔡东杰：资源，数据管理。欧一平：资源，数据管理。王明书：软件，概念化。贾仁勇：软件，概念化。陈顺：研究，数据管理。朱德康：研究，数据管理。刘玛峰：撰写——审稿与编辑，数据管理。吴英：撰写——审稿与编辑，资源。姚阳：

资助

本工作得到了成都科学技术局（2025-YF05–00721-SN）、国家自然科学基金（编号32473042）、四川省自然科学基金（2025ZNSFSC0210）以及四川农业大学的免费探索专项基金（2024ZYTS011和2521993028/2025）的支持。

利益冲突声明

作者声明本研究未涉及任何可能被视为潜在利益冲突的商业或财务关系。

致谢

本工作得到了中国农业研究系统计划（编号CARS-42-17）和四川兽医医学与药物创新组（编号SCCXTD-2020-18）的支持。