《International Journal of Biological Macromolecules》：Dual-channel constructed polycaprolactone/chitosan/stem cells nanofibers with superior activity for burns and scalds
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纳米纤维支架联合干细胞治疗烧伤的创新方法研究。通过便携式双通道电纺设备同步实现干细胞电喷雾沉积和聚己内酯/壳聚糖纳米纤维电纺，避免溶剂毒性对干细胞活性影响，使MSCs均匀分布于纤维表面，赋予支架抗菌性和促进EGF分泌的修复功能。
朱宏翔|邵润泽|张志伟|孙月汉|李玲云|龙云泽|张俊
中国山东省青岛大学物理学院先进纳米纤维创新研究所医学与健康纺织材料重点实验室，青岛，266071
摘要
烧伤和烫伤的愈合过程缓慢，这是由于伤口部位的组织丢失以及容易受到细菌感染。干细胞疗法可以补充伤口部位的缺失细胞并促进伤口愈合。然而，干细胞的活性容易受到溶剂和高分子量的聚合物的影响，这限制了干细胞疗法的效果。在这里，我们开发了一种紧凑便携的原位双通道复合电纺设备。该设备首次实现了将间充质干细胞（MSCs）附着在聚己内酯（PCL）/壳聚糖纤维表面。双通道设计防止了MSCs直接接触纺丝溶液，从而克服了溶剂对细胞活性的负面影响，并扩大了可使用的溶剂范围。这种优势是传统电纺方法（将MSCs掺入纺丝前驱体溶液中）无法实现的。实验结果证实，结合电喷雾和电纺的方法能够使MSCs在纤维中均匀分布，提高干细胞存活率，从而增强其在伤口愈合中的作用。进一步的实验表明，MSCs的掺入赋予了纳米纤维敷料抗菌性能，并通过诱导表皮生长因子的分泌来促进伤口愈合。这种干细胞疗法与纳米纤维的结合为烧伤和烫伤的治疗提供了一种有前景的新方法，适用于户外和家庭紧急处理。
引言
皮肤、黏膜及其分泌物构成了人体抵御外部病原体的第一道防线。烧伤或烫伤后，这一屏障功能会严重受损，导致细菌感染的易感性增加。在严重情况下，暴露在空气中的伤口会进一步增加感染风险[1]、[2]、[3]、[4]、[5]、[6]、[7]。迅速分离空气中的细菌可能有助于减少感染和后续并发症[8]、[9]。伤口部位的坏死细胞会阻碍组织恢复。为了恢复伤口部位的坏死细胞，目前常用的自体移植仍然面临供体组织采集和供体部位限制等并发症。研究一种替代且有效的烧伤和烫伤愈合方案以替代自体移植是生物医学领域的重要需求。该方案不仅需要防止感染并促进组织再生，还需要补充伤口部位的受损细胞。干细胞疗法，主要是指间充质干细胞（MSCs），可以通过细胞募集和分化等机制补充缺陷细胞，从而促进皮肤伤口愈合和皮肤再生，并具有治疗烧伤和烫伤伤口的能力。然而，直接将干细胞应用于伤口部位存在细胞存活率低等缺点[10]。通过电纺（ES）技术制备的纳米纤维膜可以模拟天然细胞外基质，从而促进细胞粘附并提高存活率。将干细胞与纳米纤维结合的协同策略显示出替代自体移植治疗烧伤和烫伤伤口的潜力。
目前，有两种常见的将干细胞与纤维结合的方法。一种是细胞电纺（C-ES）技术，即将细胞分散到纺丝前驱体溶液中并封装在纳米纤维中。C-ES不仅可以作为组织细胞在伤口部位的粘附、迁移和增殖的支架，还可以通过引入活细胞来补充伤口缺陷区域的细胞短缺。Wen等人通过将MSCs加载到冷鱼皮明胶的磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液中，并使用电纺技术来促进伤口愈合[10]。Liu等人将人脐带间充质干细胞加载到含有聚乙烯氧化物（PEO）和细胞培养基的PBS溶液中，通过电纺制备复合纳米纤维[11]。然而，C-ES也有一些缺点。首先，为了确保干细胞在纺丝溶液中的存活，溶剂的选择受到严格限制，主要限于水溶性溶剂。但是，制备的材料会迅速溶解在组织液中。其次，干细胞被包裹在纤维内，导致分布不均。此外，材料必须具有一定的降解性。过快的降解会阻止纳米纤维作为细胞支架的功能。相反，过慢的降解会阻碍包裹在纤维中的细胞吸收营养，导致存活率降低[12]。另一种将干细胞与纤维结合的方法是将纳米纤维浸入干细胞悬浮液中以实现干细胞接种。Mirzaei等人将聚己内酯（PCL）和胶原蛋白复合纳米纤维浸入含有大鼠脂肪源性间充质细胞的培养基中以实现干细胞接种[13]。Lee等人将大豆蛋白分离物引入纺丝前驱体溶液中以增强聚乙烯氧化物纳米纤维的细胞粘附性，然后将纤维浸入大鼠骨髓来源的间充质细胞悬浮液中，从而实现干细胞的粘附和生长[14]。然而，这种方式在纤维支架上接种的干细胞数量较少且分布不均。大多数干细胞接种在材料的外表面，容易脱落。PCL具有良好的生物相容性和生物降解性，在生物医学领域得到广泛应用。然而，其疏水性阻碍了细胞粘附。壳聚糖（CS）是一种天然多糖，具有优异的亲水性和生物降解性。Cordoba等人将CS与PCL结合，实验表明CS的引入提高了PCL的亲水性。CS可溶于弱酸，而PCL可溶于有机溶剂。因此，我们选择醋酸水溶液作为溶剂[15]。Léger等人制备了PCL/CS纳米纤维，并通过表面等离子体处理进一步增强了其亲水性，有利于干细胞衍生心肌细胞的接种[16]。电喷雾是一种电场辅助的喷涂过程，常用于微纳米粒子的精确输送。尽管之前的研究已经使用C-ES或浸渍接种方法将干细胞与纳米纤维结合，但尚无研究报道电喷雾干细胞与电纺纳米纤维的原位结合。
我们开发了一种便携式双通道设备（示意图），可以实现干细胞的电喷雾和纳米纤维的电纺，用于治疗烧伤和烫伤伤口。该设备使干细胞在纤维中均匀分布，而不仅仅是在其表面。这种便携式原位设备增强了纳米纤维对伤口的粘附。通过该设备，防止干细胞与纺丝溶液直接接触，从而克服了有毒有机溶剂对干细胞应用的限制，并提供了更多溶剂和纺丝聚合物材料的选择。为了验证我们双通道策略的通用性，我们选择了PCL和CS，因为它们具有良好的生物相容性和生物降解性，但它们的溶剂对干细胞有毒。干细胞の掺入赋予了纳米纤维敷料抗菌性能，并通过分泌表皮生长因子（EGF）来促进伤口愈合。此外，通过体内和体外实验以及EGF免疫蛋白测试，解释了促进愈合和抗菌性能的原因。
材料
PCL（分子量=80,000），CS（壳聚糖，脱乙酰度≥75%），明胶（分子量=120,000）购自上海阿拉丁生化科技有限公司。醋酸（纯度≥99%），去离子水购自国药化学试剂有限公司。小鼠骨髓间充质干细胞（MSCs），小鼠成纤维细胞（L-929），细胞计数试剂盒-CCK-8，细胞活力（活细胞和死细胞染色）检测试剂盒，PBS缓冲液购自大连美仑生物技术有限公司。所有化学品均为试剂级。
纤维表征
我们通过电纺PCL/CS纤维并同时电喷雾MSCs来制备MSCs/PCL/CS纤维（图1）。
图2a和b显示了MSCs/PCL/CS纤维的SEM图像和光学显微镜图像。与PCL/CS纤维的SEM图像（图S2）相比，图2a中出现了密集的球形颗粒，表明MSCs在PCL/CS纤维表面均匀分布。此外，从图2b的光学显微镜图像可以看出，在较大的宏观视野中，通过比较...
结论
首次提出了原位电喷雾MSCs和原位电纺PCL/CS纳米纤维的结合方法，并设计开发了一种原位双通道复合电纺设备。该设备小巧便携，可以将MSCs附着在PCL/CS纤维表面。这种结合电喷雾和电纺的方法避免了干细胞与纺丝溶液的直接接触，从而克服了溶剂对细胞活性的负面影响，并扩大了...
作者贡献声明
朱宏翔：撰写 – 原始草稿，方法学，数据分析。邵润泽：方法学，数据分析。张志伟：方法学，数据分析。孙月汉：方法学，数据分析。李玲云：方法学，数据分析。龙云泽：撰写 – 审稿与编辑，验证，监督。张俊：撰写 – 审稿与编辑，监督。
伦理声明
参与本项目动物实验的所有人员都通过了动物实验操作评估，实验程序严格遵循青岛大学动物福利伦理要求。由于SD大鼠具有很强的适应性和疾病抵抗力，因此适合用于构建该实验模型。SD大鼠购自济南鹏跃动物繁殖有限公司，许可证编号：SCXK (Lu) 2022-0006。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（52273077）和青岛大学生物纤维与生态纺织品国家重点实验室（ZDKT202108和G2RC202022）的支持。
