探索壳聚糖-α-硫辛酸共聚物/海藻酸钠包覆的中空玉米醇溶蛋白纳米颗粒在口服虾青素递送方面的潜力：结构表征、安全性评估及抗溃疡性结肠炎作用

《International Journal of Biological Macromolecules》：Exploring the potential of chitosan- α-lipoic acid copolymer/sodium alginate-coated hollow zein nanoparticles for oral astaxanthin delivery: Structural characterization, safety assessment and anti-ulcerative colitis effect

pH和还原性敏感纳米递送系统通过空心Zein/壳聚糖-α-脂酸/藻酸钠三明治结构实现靶向递送，显著改善溃疡性结肠炎小鼠模型的体重损失、肠道屏障损伤及炎症因子水平，同时增强虾青素抗氧化活性并调节肠道菌群，验证了新型载体在UC治疗中的潜力。

　　

魏王|崔燕|李晓明|田淑琳|郑明珠|王玉华|修琳|刘慧敏

吉林农业大学食品科学与工程学院，中国吉林省长春市，130118

摘要

溃疡性结肠炎（UC）是一种慢性炎症性肠病，其特征是结肠黏膜屏障受损、持续炎症和肠道微生物群失调。然而，当前疗法的主要局限性在于它们在炎症部位的分布不具针对性，且药物在病变部位的积累不足。本研究开发了一种对pH值和氧化还原状态敏感的纳米粒子递送系统，以增强UC的治疗效果。这些纳米粒子由中空玉米醇溶蛋白、壳聚糖-α-硫辛酸共聚物和海藻酸钠交替层组成，形成了聚电解质多层核壳结构。本研究中选择的包封物质是天然抗炎化合物虾青素（AXT）。透射电子显微镜分析表明AXT被成功包封，纳米粒子呈现平均直径约为295.4纳米的中空球形结构。AXT与纳米粒子之间的相互作用主要是氢键和疏水作用。此外，这些纳米粒子在体内表现出优异的安全性，并显著增强了AXT的抗氧化活性。体内实验表明，载有AXT的纳米粒子显著减轻了由硫酸葡聚糖诱导的小鼠体重减轻、疾病活动指数、结肠黏膜损伤和炎症。更重要的是，载有AXT的纳米粒子在缓解UC方面比游离AXT具有更显著的效果。这些纳米粒子还能增加肠道微生物群的丰富度和多样性，从而维持UC的治疗效果。这些结果证实了该纳米递送系统在UC治疗中的巨大潜力。

引言

溃疡性结肠炎（UC）是一种无法治愈的炎症性肠病，其特征是慢性肠道炎症，严重威胁人类健康[1]。UC的症状包括腹泻、体重减轻和便血，其致病因素主要与肠道屏障受损、炎症细胞浸润和肠道微生物群失衡有关[2]。临床上已使用多种疗法（如皮质类固醇、氨基水杨酸和阿达利姆单抗）来缓解UC的进展。然而，由于这些疗法的疏水性、易代谢性、疗效不佳和严重副作用，其应用受到限制。因此，迫切需要探索新的干预方法来应对UC治疗的巨大挑战。

与静脉注射相比，口服给药因其提高的患者依从性和成本效益而成为更受欢迎的方法[3]。利用这些优势，已经开发了多种用于UC治疗的口服递送系统，包括微凝胶、脂质体和纳米粒子[4]。其中，纳米粒子因其优异的溶解性、物理化学稳定性以及渗透性和滞留效应而受到广泛关注。特别是基于玉米醇溶蛋白的载体因其良好的生物相容性、易于制备和能够形成稳定的纳米结构而受到重视[5]。先前研究中开发的多种基于玉米醇溶蛋白的纳米粒子（包括实心核型和成膜型）在提高包封药物的溶解性和稳定性方面显示出有希望的结果。例如，玉米醇溶蛋白/硫酸软骨素纳米粒子[5]、玉米醇溶蛋白/壳聚糖纳米粒子[6]、玉米醇溶蛋白/果胶/维生素B9纳米粒子[7]和玉米醇溶蛋白/透明质酸纳米粒子[8]均表现出优异的胶体稳定性、缓释性能和生物相容性。然而，尽管具有这些优势，现有的基于玉米醇溶蛋白的载体通常具有较低的载药能力，这限制了它们的治疗效果。这一挑战需要探索创新的结构设计来提升这些载体的功能性能。为了解决这一问题，我们之前的研究专注于在玉米醇溶蛋白载体中开发中空结构。通过制备中空玉米醇溶蛋白纳米粒子（HZs），我们显著提高了载药能力，同时保持了理想的释放特性。使用碳酸钠牺牲模板法制备的HZs与实心核玉米醇溶蛋白纳米粒子相比，载药能力显著提高[9]。然而，这些系统的整体疗效仍有限，主要原因是难以实现活性成分的靶向递送和可控的细胞内释放。

炎症性结肠组织具有较高的代谢活性，导致酸性代谢物积累和氧化应激增加，其特点是pH值较低（约6.0）和谷胱甘肽水平升高[10]。鉴于炎症环境中的独特pH值和氧化还原条件，已经设计了创新的结肠靶向药物递送系统来应对这些因素。孙等人通过将菊粉与氯乙酸反应并进一步用4-氨基噻吩修饰，合成了对pH值和氧化还原状态敏感的复合纳米粒子，用于布地奈德的递送[11]。还制备了一种对pH值和氧化还原状态响应的白藜芦醇载有机硅纳米粒子递送载体，并通过靶向成分硫酸软骨素进行了功能化[12]。这些系统旨在减少药物在上消化道的损失，同时提高肠道炎症区域的药物吸收。

基于这一原理，设计了具有pH值/氧化还原响应特性的壳聚糖-α-硫辛酸共聚物（CL）外层，以包裹HZs，避免其在到达胃肠道前产生全身性效应。壳聚糖在UC靶向药物递送中起着关键作用，因为它具有生物相容性、无毒性和生物降解性、抗氧化活性、化学稳定性和pH响应性[13][14]。α-硫辛酸中的二硫键赋予纳米粒子氧化还原响应特性，使药物释放受炎症细胞中谷胱甘肽浓度的调控[15]。考虑到CL的正电荷特性，需要一层负电荷层来构建静电稳定的保护壳结构。此外，由于炎症性肠上皮细胞表面和微环境中阳离子蛋白浓度较高，负电荷纳米粒子倾向于在炎症部位积聚，因此选择了海藻酸钠（SA）。最终，纳米粒子形成了具有pH值和氧化还原响应特性的三层结构。我们之前的研究表明，在模拟结肠条件的情况下（pH 6.0，2 mM谷胱甘肽），HZ/CL/SA纳米粒子（HCSs）有效释放了约81.1%的AXT，验证了其结肠靶向递送潜力[16]。此外，这些纳米粒子表现出优异的环境稳定性，在30天的储存期内粒径没有显著变化。尽管这些体外特性很有前景，但HCSs的体内生物相容性和结肠特异性递送效果仍有待评估。更重要的是，目前关于这类递送系统的研究主要集中在体外概念验证上，而在活体生物体的复杂生理环境中对其安全性、靶向准确性和治疗效果的全面评估仍然十分缺乏。

为了解决这一不足，我们选择了虾青素（AXT）作为模型生物活性化合物，因为它具有显著的抗氧化、抗炎和免疫调节作用。然而，AXT在功能性食品中的应用潜力受到其不良口服递送特性的严重限制，包括水溶性差、胃肠道不稳定性和快速代谢清除[9]。为了克服这些障碍，我们将AXT包封在设计的HCSs中，并系统研究了AXT与HCSs之间的分子相互作用。此外，鉴于新型HCSs载体在体内的生物安全性和生物学性能尚未充分阐明，本研究全面评估了载有AXT的HZ/CL/SA纳米粒子（HCSs-AXT）的全身安全性及其在小鼠结肠炎模型中的肠道健康干预效果。这些努力共同提供了一种新型的食品级结肠靶向递送系统，为开发针对肠道健康的靶向营养干预食品提供了可行的技术途径。

材料

玉米醇溶蛋白（纯度≥98%）、海藻酸钠（纯度≥98%）和α-硫辛酸（纯度≥99%）购自源远生物技术有限公司（中国上海）。硫酸葡聚糖（DSS）购自美仑生物技术有限公司（中国大连）。虾青素（AXT，纯度≥96%）和壳聚糖（脱乙酰度≥85%）购自麦克林生化科技有限公司（中国上海）。一氧化氮（NO）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）和小鼠白细胞介素-10（IL-10）的检测试剂盒

HZCSs-AXT的制备与表征

HZCSs-AXT是通过逐层自组装技术使用碳酸钠作为牺牲模板制备的，如图1A所示。具体步骤是将AXT加入玉米醇溶蛋白溶液中，然后逐滴加入碳酸钠。将上述体系与去离子水混合并通过旋转蒸发去除乙醇，从而获得HZs-AXT。随后利用静电作用原理，将阳离子CL和阴离子SA逐层涂覆在HZs-AXT表面

结论

本研究开发了具有pH值和氧化还原响应特性的中空玉米醇溶蛋白纳米粒子，能够将AXT靶向递送到UC病变部位。合成的HZCSs-AXT具有约295.4纳米的均匀粒径和明显的中空球形形态。它们通过减少DSS对结肠组织的影响和降低结肠中促炎细胞因子的产生，减轻了DSS诱导的小鼠结肠损伤，且其治疗效果优于AXT单独使用。

CRediT作者贡献声明

魏王：撰写初稿、软件开发、数据分析。崔燕：撰写初稿、数据分析。李晓明：方法学设计、数据分析。郑明珠：撰写与编辑、方法学设计。王玉华：撰写与编辑、方法学设计。修琳：验证、项目管理、实验设计、概念构思。刘慧敏：验证、项目管理、实验设计、资金获取、概念构思。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

本研究得到了国家重点研发计划（2022YFF1100205）的支持。