编辑推荐：
人参皂苷K通过抑制G-四联体RNA凝胶化及与多肽共聚集，减少C9orf72相关ALS/FTD的毒性RNA焦点形成，为神经退行性疾病治疗提供新策略。
李友端|刘书杰|曹玲玲|朱明|林双|王新欣|邱志东|滕叶
长春中医药大学药学院，中国长春市博硕路1035号，邮编1301171
摘要
C9orf72基因中的GGGGCC重复序列扩展是导致肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶痴呆（FTD）最常见的遗传原因。这种扩展会产生有毒的RNA重复序列和多肽，从而导致神经细胞中的异常相分离和沉积。特别是，这些重复RNA会形成凝胶，引发细胞毒性。因此，它们成为潜在的治疗靶点。人参皂苷K（CK）是人参的主要代谢产物，人参是一种常用于治疗神经退行性疾病的传统中药。在本研究中，CK在体外和体内均显著抑制了GGGGCC重复序列的凝胶化过程。此外，它还通过静电相互作用减少了RNA和富含精氨酸的多肽的聚集。进一步的研究表明，CK优先与GGGGCC重复序列形成的G四链体单体相互作用，从而抑制了有毒RNA焦点的形成。这些结果阐明了CK在C9orf72相关ALS/FTD中的作用机制。因此，本研究为人参皂苷在神经退行性疾病治疗中的应用提供了新的途径。
引言
C9orf72基因中的GGGGCC重复序列扩展是导致肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶痴呆（FTD）最常见的遗传原因[1] [2]。其主要机制包括C9orf72功能的丧失、有毒RNA重复序列的产生以及有毒RNA和多肽的积累[3]。这些重复序列会形成各种二级结构，如发夹结构、G四链体、i基序和R环[4] [5] [6]，这会导致DNA在复制和转录过程中的损伤增加和基因组不稳定[7]。转录后的RNA重复序列会与RNA结合蛋白形成有毒RNA焦点，导致蛋白质的隔离[3]。此外，这些转录后的重复RNA可以通过非ATG翻译（RAN翻译）产生多肽，包括聚甘氨酸-丙氨酸（poly-GA）、聚甘氨酸-脯氨酸（poly-GP）、聚甘氨酸-精氨酸（poly-GR）、聚脯氨酸-丙氨酸（poly-PA）和聚脯氨酸-精氨酸（poly-PR）[8]。这些多肽会损害神经系统[9]。例如，poly-GR和poly-PR会与mRNA形成不溶性复合物，阻断其翻译[10]；poly-PR会结合到核孔上，阻断核质运输[11]；同样，Poly-GA会形成有毒的淀粉样蛋白，影响核质运输和细胞间信号传递[12]。
由重复RNA形成的RNA焦点在神经元中频繁出现，并与病理疾病特征相关。因此，它们引起了广泛的研究兴趣。像CAG和GGGGCC这样的重复序列通过多价碱基配对形成凝胶，这有助于神经退行性疾病的发病[13]。特别是，由于其高GC含量，GGGGCC重复序列会形成多种二级结构，包括分子内和分子间的G四链体及发夹结构，这些结构与RNA焦点的形成有关。因此，近年来针对GGGGCC重复序列的研究成为C9orf72相关ALS研究的重要课题。多种蛋白质可以与GGGGCC重复序列结合，调节RNA焦点的表达和形成。例如，异质核核糖核蛋白A3和锌指蛋白106可以与GGGGCC重复序列结合，减少RNA焦点并抑制多肽的积累[14] [15]。另外，改变GGGGCC重复序列的结构可能是一种有前景的治疗方法。Miyoshi等人[16]发现，胞嘧啶甲基化可以通过调节G四链体的拓扑结构（从平行结构变为反平行结构）来抑制其相分离。此外，小分子配体ANP77可以与反义GGCCCC重复序列中的胞嘧啶形成伪规范碱基对，显示出其在针对RNA驱动性疾病中的非规范核酸结构方面的潜力[17]。
人参是一种常用于治疗神经退行性疾病的传统草药[18] [19]。现代药理学研究证实，人参对神经系统、心血管系统和内分泌系统具有显著作用[20] [21]，但其药理作用机制尚不清楚。人参皂苷是人参中的主要活性成分，目前已鉴定出200多种不同类型的人参皂苷[22]。人参皂苷K（CK）是原人参二醇皂苷的主要代谢产物，具有抗炎、抗癌、抗衰老和神经保护等多种生物活性[23] [24] [25]。在之前的研究中，CK通过促进G四链体的折叠和调节含有G四链体的癌基因的表达，影响了双链体和G四链体的平衡[26]。其在调节核酸结构方面的潜力表明，它在延缓神经退行性病变发展中起着重要作用。本研究在体外和体内探讨了CK对GGGGCC重复序列凝胶化的影响。在CK的作用下，有毒RNA焦点的形成被抑制，同时RNA重复序列和富含精氨酸的多肽（如poly-GR和poly-PR）的聚集也被减少。因此，CK的治疗效果为药物开发提供了新的途径，并突显了其在神经退行性疾病治疗中的潜在应用。
试剂和材料
DNA序列购自上海 Sangon生物技术有限公司（中国上海），无需进一步纯化即可使用。序列信息列于表S1中。T7 RNA聚合酶、DNase I、重组RNase抑制剂和rNTPs购自Takara生物医学技术有限公司（中国北京）。所有其他试剂均来自上海源叶生物技术有限公司（中国上海）。溶液均使用Barnstead Smart2Pure纯化的蒸馏水配制。
CK抑制了GGGGCC重复序列的凝胶化
在体外转录后观察到了GGGGCC重复序列的凝胶化现象。设计了一个包含八个GGGGCC重复序列和T7启动子区域的模板（图1A）。转录2小时后，通过变性凝胶电泳对转录产物进行了分析。如图S1所示，在有无CK的情况下，转录产物的数量没有显著差异。这表明CK对GGGGCC重复序列的表达水平影响很小。
讨论
RNA和蛋白质的相分离是无膜细胞器形成和调控的关键因素，因此在与年龄相关的疾病研究中受到了关注。RNA的相分离受到RNA结构的严格控制。特别是在重复序列扩展相关疾病中，扩展的RNA重复序列会形成多种分子间结构，如发夹结构、G四链体和i基序，从而导致有毒RNA凝胶的形成。
结论
CK抑制了GGGGCC重复序列的凝胶化，并影响了RNA重复序列和富含精氨酸的多肽的聚集。本研究提供了基于证据的机制，说明CK在分子水平上如何延缓神经退行性病变的发展。人参皂苷及其类似化合物可能是开发治疗以异常蛋白质和RNA聚集为特征的神经退行性疾病的新方法的宝贵资源。
作者贡献声明
李友端：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、验证、方法学设计、实验设计、概念构思。
刘书杰：验证、方法学设计、实验设计。
曹玲玲：资源提供。
朱明：验证。
林双：数据可视化。
王新欣：数据可视化。
邱志东：撰写 – 审稿与编辑、实验监督、资源提供。
滕叶：概念构思、资源提供、实验监督、初稿撰写、审稿与编辑。
资助
本研究得到了国家自然科学基金 [项目编号：82204650]和吉林省自然科学基金 [项目编号：YDZJ202501ZYTS223]的支持。
利益冲突声明
作者声明没有利益冲突。
