埃及伊蚊Hsp70在氧化应激下具有增强的ATP酶活性与蛋白保护功能

《International Journal of Biological Macromolecules》：Aedes aegypti Hsp70 has enhanced ATPase and protein protection under oxidative stress

本研究聚焦伊蚊传播疾病防控难题，研究人员对埃及伊蚊胞质伴侣蛋白AaHsp70进行了首次系统表征。结果表明，与人类同源蛋白相比，AaHsp70展现出显著增强的ATP酶活性，在氧化应激下尤为突出，并能有效防止包括肌动蛋白在内的多种蛋白发生聚集。该研究揭示了AaHsp70在维持蚊子细胞氧化还原稳态中的关键作用，为针对该分子靶点开发新型病媒控制策略提供了重要理论基础。

　　

在全球变暖的背景下，以埃及伊蚊（Aedes aegypti）为代表的蚊媒正以前所未有的速度扩张其领地，成为登革热、寨卡、黄热病和基孔肯雅热等病毒性疾病传播的“高效特快专列”。尽管人类投入了巨大的努力来控制蚊虫和病毒，但问题却日益严峻。蚊虫为何如此“顽强”？一个重要原因在于其卓越的环境适应能力，特别是应对各种细胞压力（如高温、氧化应激）的生存机制。细胞内蛋白质在压力下容易错误折叠并聚集，导致细胞死亡。为此，细胞演化出了一套精密的“蛋白质质检系统”（Protein Quality Control, PQC），而Hsp70（热休克蛋白70）家族正是这个系统的核心“维修工”兼“质检员”。它如同一个分子“抓手”，帮助新生蛋白正确折叠，挽救错误折叠的蛋白，或将无法修复的蛋白送去降解。如果我们能深入了解埃及伊蚊的Hsp70，或许就能找到干扰其生存的“阿喀琉斯之踵”，为开发新型蚊媒防控手段开辟道路。为此，来自巴西坎皮纳斯大学的研究团队首次对埃及伊蚊的胞质Hsp70（命名为AaHsp70）进行了全面的生物物理和功能表征，相关成果发表在《International Journal of Biological Macromolecules》上。

为开展此项研究，研究人员采用了多种关键技术方法。他们利用生物信息学工具从埃及伊蚊基因组中鉴定并克隆了AaHsp70基因，在大肠杆菌中异源表达并纯化获得了高纯度重组蛋白。通过圆二色谱（CD）、内源荧光光谱和尺寸排阻色谱耦合多角度光散射（SEC-MALS-QELS）等技术，表征了AaHsp70的结构、折叠状态、热稳定性及在溶液中的寡聚状态。通过偶联的ATP酶活性测定法，比较了AaHsp70与人源HSPA1A、HSPA8的ATP酶活性，并评估了氧化处理（H₂O₂）及人源Hsp40共伴侣蛋白（DNAJA1, DNAJB4）对其活性的影响。使用溶菌酶和胰岛素作为模型客户蛋白，在二硫苏糖醇（DTT）诱导的还原应激下，通过光散射监测评估了AaHsp70的ATP非依赖性“holder”分子伴侣活性。此外，还利用来源于埃及伊蚊C6/36细胞和E. coliDH5-alpha细胞的提取物，在更接近生理环境的条件下，评估了AaHsp70保护内源性蛋白质（特别是β-肌动蛋白）免受DTT诱导聚集的能力，并通过Western blot进行了验证。

3.1. 埃及伊蚊编码一个经典的Hsp70蛋白

研究人员首先通过生物信息学分析确认，AaHsp70是一个由636个氨基酸残基组成的经典Hsp70蛋白，包含N端核苷酸结合结构域（NBD）和C端底物结合结构域（SBD），后者又分为SBDα和SBDβ亚结构域。序列比对显示它与人类应激诱导型HSPA1A同源性（74.2%）高于组成型HSPA8（72.8%）。引人注目的是，AaHsp70含有10个半胱氨酸残基，远多于人类Hsp70典型的4个，暗示其可能对氧化还原状态高度敏感。系统发育分析表明，双翅目昆虫的Hsp70同源物聚集在一个进化分支中。

3.2. 重组AaHsp70以折叠的单体形式高纯度获得

通过圆二色谱和荧光光谱分析证实，重组表达的AaHsp70具有正确的α螺旋二级结构和天然折叠构象。热诱导去折叠实验显示其存在两个转变，分别对应NBD和SBD，且ATP的加入能将NBD的转变中点温度（T_m）从35°C提升至40°C，表明ATP稳定了NBD结构。然而，其非折叠态的T_m低于许多已知Hsp70同源物，暗示其可能需要体内伴侣蛋白来维持稳定。SEC-MALS-QELS分析证实，AaHsp70在溶液中以单体形式存在，分子量约为73.9 kDa，并具有延伸的非球形构象。

3.3. AaHsp70具有增强的ATP酶活性，且受Hsp40的刺激有限

ATP酶活性测定揭示了AaHsp70的一个关键特征：其基础ATP酶活性是人源HSPA1A的约3.3倍，是HSPA8的约2.5倍。在氧化应激（H₂O₂处理）条件下，其活性进一步增强了90%，且这种增强在还原剂DTT存在时可逆。相比之下，人源HSPA1A活性仅增加约30%，HSPA8增加约10%。当加入人源Hsp40共伴侣蛋白（DNAJA1或DNAJB4）或其J结构域时，对AaHsp70 ATP酶活性的刺激（约15%）远弱于对人源HSPA1A的刺激（约60%），这可能源于其自身已具备高效的水解能力。

3.4. AaHsp70保护客户蛋白免受DTT诱导的聚集

研究人员评估了AaHsp70在氧化还原应激下的分子伴侣功能。在DTT存在的还原性环境中，模型客户蛋白溶菌酶和胰岛素会迅速展开并聚集。预先加入AaHsp70可显著抑制这种聚集，将聚集水平降低约70%，证明了其作为ATP非依赖性“holder”的伴侣活性。这与其底物结合口袋中保守的疏水性氨基酸残基相匹配。

3.5. 埃及伊蚊细胞表达AaHsp70

通过Western blot，研究人员在埃及伊蚊C6/36细胞的裂解液中检测到了内源性AaHsp70的表达，证实该蛋白在蚊子细胞中基础表达，即使在没有外部压力的情况下也存在。

3.6. AaHsp70在细菌和昆虫细胞提取物中保护蛋白质免受DTT诱导的沉淀

在更接近生理环境的复杂体系——E. coli和埃及伊蚊C6/36细胞的全细胞提取物中，DTT处理导致了大量蛋白质沉淀。而添加重组AaHsp70能显著减少沉淀，在两种提取物中分别降低约60%和65%的蛋白质聚集。SDS-PAGE和随后的Western blot分析特别指出，一个在45 kDa附近显著聚集的蛋白条带被鉴定为β-肌动蛋白。DTT处理导致β-肌动蛋白聚集增加约77%，而AaHsp70的存在不仅完全阻止了这种应激诱导的聚集，还额外保护了约25%在常规条件下本会沉淀的肌动蛋白，突显了其对细胞骨架关键组分的强大保护作用。

结论与意义

本研究首次全面表征了埃及伊蚊胞质Hsp70（AaHsp70）。综合结果表明，AaHsp70是一个独特的、在溶液中为单体形式的分子伴侣。其最显著的特征包括：基础ATP酶活性远超人类同源蛋白；富含半胱氨酸，对氧化还原状态高度敏感，氧化应激下活性大幅增强；热稳定性相对较低；并能以ATP非依赖的方式有效保护多种蛋白质（包括至关重要的肌动蛋白）在还原应激下不发生聚集。

这些特性共同支持了一个假说：AaHsp70在埃及伊蚊细胞中扮演着一个组成型表达、但功能特化的伴侣蛋白角色，其核心功能可能是维持氧化还原稳态。鉴于氧化还原平衡深刻影响蚊子的生理、对病原体的易感性（媒介效能）以及对杀虫剂的反应，AaHsp70的这一功能显得尤为重要。例如，目前一种有前景的生物防控策略是利用Wolbachia感染蚊子，其机制部分就是通过诱导氧化应激来抑制病毒复制。因此，像AaHsp70这样在氧化应激响应中起关键作用的蛋白，成为了极具潜力的新型分子靶点。

该研究的发现具有重要的转化意义。肌动蛋白是细胞骨架的核心，对蚊子幼虫的发育、形态建成和运动至关重要，已有研究表明干扰肌动蛋白功能会严重阻碍幼虫发育。AaHsp70被证明能有效保护肌动蛋白免于应激聚集，这意味着如果能够开发出特异性抑制AaHsp70功能的化合物，就可能破坏蚊子细胞内的蛋白质稳态，特别是影响肌动蛋白等关键蛋白的功能，从而削弱蚊子的生存力、发育或繁殖能力，为控制蚊媒种群和阻断疾病传播提供全新的策略思路。这项工作不仅增进了对埃及伊蚊基础生物学的理解，也为未来开发针对这一关键伴侣蛋白的干预措施奠定了坚实的科学基础。