利用溶液栅控石墨烯晶体管和聚腺嘌呤DNA组装的探针，实现对piR-54265生物标志物的超灵敏且无标记检测，从而准确诊断结直肠癌

《Chemical Engineering Journal》：Ultrasensitive and label-free detection of piR-54265 biomarker by solution-gated graphene transistors with poly-adenine DNA assembled probe for accurate diagnosis of colorectal cancer

本研究开发了一种基于溶液栅石墨烯晶体管（SGGT）的高灵敏度生物传感器，用于检测结直肠癌相关piRNA-54265。通过设计L型PolyA15T5-DNA探针优化门电极表面修饰，实现8.56×10^-19 M的超低检测限和1 aM至10 nM的线性范围，临床血清检测显示CRC患者与非癌对照组的AUC为1.0，为非侵入性癌症诊断提供新工具。

　　

余婷婷|宋鹏|王瑞雪|陈子文|赵亮|王明|王建英|梅涛|王显宝|李金华

教育部绿色制备与应用功能材料重点实验室，省部共建先进有机化学材料协同创新中心，湖北大学新能源与电气工程学院，武汉，430062，中国

摘要

结直肠癌（CRC）是全球发病率和死亡率均较高的恶性肿瘤之一。传统的筛查方法，如内镜检查和粪便检测，具有侵入性且依从性较低，这凸显了高效、无创诊断方法的迫切需求。循环小RNA（包括被标注为PIWI相互作用RNA-54265（piR-54265）的序列）已被报道与CRC密切相关，并在液体活检研究中成为有前景的血清生物标志物。本研究旨在开发一种超灵敏的、无标记的溶液门控石墨烯晶体管（SGGT）生物传感器，用于检测血清样本中的piR-54265，以解决当前CRC生物标志物检测的局限性。设计了一种Polyadenine₁₅-thymine₅（PolyA₁₅T₅-DNA）探针，采用L形结构构建传感界面。这种结构有助于探针在栅极界面处形成有利于核酸识别的构象，从而提升生物传感器的整体性能。该生物传感器实现了8.56?×?10^?19?M的显著检测限（LOD），线性检测范围为1 aM至10?nM，并对piR-54265具有优异的选择性。在稀释条件下分析的临床血清样本显示CRC患者与非癌对照组之间存在明显差异，接收者操作特征（ROC）分析进一步证实了其卓越的诊断性能，曲线下面积（AUC）达到1.0。这些结果建立了一个基于SGGT的传感平台，用于检测与CRC相关的RNA，展现了其在无创生物标志物检测和未来诊断应用中的潜力。

引言

结直肠癌（CRC）是全球最常见的胃肠道恶性肿瘤之一，约占所有癌症病例的10%，在癌症相关死亡率中排名第二[1]、[2]、[3]。近年来，CRC的发病率迅速上升，尤其是在年轻人群中，这主要是由于饮食习惯和生活方式的变化[4]、[5]。早期检测对CRC的预后至关重要，因为及时干预可以显著改善患者预后。目前用于早期CRC的诊断方法包括结肠镜检查、粪便隐血检测（FOBT）[6]、[7]、癌胚抗原（CEA）[8]、[9]、[10]、碳水化合物抗原（CA19-9）水平[11]以及粪便DNA检测[12]、[13]。尽管CEA是一种广泛使用的生物标志物，但其临床效用受到低特异性和低灵敏度的限制，尤其是在疾病早期阶段。因此，迫切需要更可靠和灵敏的CRC检测生物标志物。

最近，一类被称为P元件诱导的WImpy睾丸蛋白相互作用RNA（PIWI相互作用RNA，piRNAs）的小型非编码核糖核酸（RNAs）因其在癌症诊断中的潜在作用而受到关注[14]、[15]。典型的piRNAs是与PIWI蛋白（Argonaute家族成员）相互作用的小RNA，参与调控重要生物过程的基因沉默途径[16]、[17]、[18]、[19]。值得注意的是，已有几种被标注为piRNAs的RNA与CRC的起始、进展和转移有关，且piRNA序列和PIWI蛋白在CRC中均表现出异常表达模式[20]、[21]。其中，被标注为PIWI相互作用RNA-54265（piR-54265）的RNA序列被认为与癌症发展相关，并可作为CRC的潜在预后生物标志物。先前的研究表明，与其他癌症类型相比，piR-54265在CRC中的水平升高[22]。相比之下，piR-823和piR-31143在多种癌症中都有表达，这可能导致诊断假阳性的风险增加[23]、[24]、[25]。此外，piR-54265在CRC患者和对照组之间的表达变化比piR-823更为明显，其水平与肿瘤分期相关，表明其具有更好的诊断区分度和临床相关性。重要的是，piR-54265已被报道与PIWIL2相互作用，并促进PIWIL2/STAT3/p-SRC复合物的形成，从而持续激活STAT3信号通路，促进结直肠癌细胞的增殖、侵袭和化疗耐药性[26]、[27]。此外，piR-54265在患者血清中可稳定检测到，支持其作为液体活检生物标志物的潜力[26]。血清的优势在于其杂质干扰少且预处理简单，无需依赖微流控技术来解决繁琐的处理问题，而血浆和其他样本来源则不然[28]、[29]、[30]、[31]。鉴于piR-54265与CRC的强关联及其在血清中的易检测性，它被认为是有用的筛查生物标志物的有希望候选者。尽管piRNAs作为生物标志物具有潜力，但当前的检测方法仍存在明显的局限性，阻碍了它们的常规临床应用：依赖复杂设备和繁琐的操作程序，例如需要多步骤RNA提取和扩增的实时定量PCR（RT-qPCR），这既耗时又依赖于专业技术人员[32]。近年来，关于piRNA生物标志物检测的相关报告不断涌现。例如，李等人[33]开发了一种基于MoS₂@ReS₂/Ti₃C₂混合-DSN信号放大的光电化学（PEC）生物传感器，能够超灵敏地检测血清中的piR-31143。该传感器可实现10^?1-10⁶ fM的线性检测范围和23 aM的检测限（LOD），具有良好的稳定性和特异性，但这种方法依赖于信号放大且操作繁琐。这些局限性凸显了开发新型、灵敏且用户友好的piRNA检测平台的必要性。

在生物分子的电检测领域，传统的离子敏感场效应晶体管（ISFETs）通常在有效功能化半导体-介质界面方面面临挑战[34]。因此，样品中的分析物常常吸附或附着在栅极氧化物上，从而调节界面处的电容和电场[35]。相比之下，基于石墨烯场效应晶体管（gFET）的生物传感器具有许多潜在优势，包括较大的表面积、高载流子迁移率和低成本[36]、[37]。gFET的通道由单层二维（2-D）碳原子组成，可以直接功能化或吸附生物分子，为生物传感器应用提供了独特优势[38]、[39]。然而，这一特性也引入了狄拉克点电流不稳定性和易漂移的新挑战。为了解决这个问题，我们的团队提出将栅极作为主要探针进行功能化，即溶液门控石墨烯晶体管（SGGT）。有效功能化栅极可以在保持石墨烯优异电性能的同时稳定输出信号。由于石墨烯的优异电性能和晶体管的信号放大作用，SGGT提供了快速、高灵敏度的检测，并具有集成到便携式诊断设备中的潜力[40]、[41]。此外，SGGT的低工作电压（≤1?V）确保了目标分子的生物活性得以保留，使其特别适合生物分子检测[42]。多项研究表明，SGGT传感器能有效检测细菌[43]、DNA[44]和miRNA[45]等生物分子。在这项工作中，我们专注于设计Polyadenine₁₅-thymine₅-DNA（PolyA₁₅T₅-DNA）探针及其与SGGT的集成，旨在调节探针在Au栅极界面上的固定，以实现核酸检测。PolyA₁₅段作为Au表面的锚定块，而T₅段的引入将识别域从表面扩展出去，促进可访问的界面配置。在相关系统中，已报道PolyA介导的表面锚定会影响探针的堆积和界面组织，从而减轻局部拥挤并促进杂交[46]。观察到的PolyA₁₅T₅基界面的增强电响应与更易访问且空间阻碍较小的探针层一致。此外，分子动力学模拟显示连续的腺嘌呤可以通过疏水塌陷与Au表面形成强吸附[47]。这些发现表明，基于PolyA₁₅T₅的锚定可能为Au表面的核酸检测提供有利的界面配置。基于此，本研究的核心目标是针对CRC特异性的piR-54265，使用SGGT构建诊断平台。本研究的具体范围如下：（I）设计和优化PolyA₁₅T₅-DNA探针，以实现与piR-54265的特异性结合。（II）使用SGGT生物传感器在aM水平上实现超高分析灵敏度和宽动态范围。（III）验证该生物传感器区分临床血清样本中CRC患者和非癌对照组的能力。

在这里，我们开发了一个用于检测piR-54265生物标志物的SGGT平台，重点关注集成PolyA₁₅T₅探针设计作为界面配置模型和栅极界面功能化。该平台将PolyA₁₅T₅-DNA探针功能化到晶体管栅极上。这种探针具有腺嘌呤（A）碱基对金（Au）表面的强亲和力，能够稳定附着在Au栅极上。PolyA₁₅T₅-DNA探针的PolyA段可以很好地锚定在Au表面，而T₅段有助于与单链DNA（ssDNA）的有效杂交。SGGT生物传感器表现出卓越的灵敏度，检测限（LOD）低至8.56?×?10^?19?M，检测时间仅需15分钟。重要的是，SGGT生物传感器已成功应用于临床血清样本，能够有效区分CRC患者和非癌对照组，验证了其作为CRC诊断工具的潜力。

材料与试剂

材料与试剂

乙醇（C₂H₆O，AR，99%）和丙酮（C₃H₆O，AR，99%）购自中国北京的中药有限公司。使用CVD技术在铜箔上生长的单层石墨烯来自中国深圳的Six Carbon Technologies公司。玻璃基底购自中国洛阳的Guluo Glass有限公司。聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、聚二甲基硅氧烷（PDMS）、六水合三氯化铁（FeCl₃·6H₂O，AR，99%）、高纯度L-乳酸（≥90%）和6-巯基-1-己醇（C₆H₄OS）

SGGT生物传感器的栅极修饰和检测过程

图1展示了SGGT生物传感器的栅极修饰和检测过程的示意图。为了减少石墨烯通道上的非特异性吸附，通过一步法合成了L形PolyA₁₅T₅-DNA探针，并将其固定在Au栅极电极上。所提出的L形界面配置是由于PolyA和PolyT段对Au表面的亲和力差异显著而合理化的

结论

总之，我们成功开发了一种基于SGGT的高灵敏度、无标记的核酸生物传感器，用于检测与CRC相关的RNA序列piR-54265生物标志物。设计的PolyA₁₅T₅-DNA探针采用了L形界面配置，旨在形成有利于核酸识别的界面。制备的SGGT生物传感器表现出低检测限（LOD为8.56?×?10^?19?M）和宽线性检测范围（1 aM至10?nM），以及良好的

CRediT作者贡献声明

余婷婷：撰写——原始草案、方法学、数据分析、概念化。宋鹏：软件、方法学。王瑞雪：实验研究、数据分析。陈子文：软件、实验研究。赵亮：撰写——审阅与编辑、资源协调。王明：监督、资源协调。王建英：监督。梅涛：可视化、验证。王显宝：监督、实验研究。李金华：撰写——审阅与编辑、资金申请。

利益冲突声明

作者声明他们与本研究无利益冲突。

致谢

本研究得到了湖北省科学技术厅（2020BIB020）、国家自然科学基金（82100704）和海外专家引进学科创新中心（D18025）的财政支持。