《Metabolic Engineering》：Enhanced methanol metabolism via reinforced cellular energy and reducing power supply for sustainable carbon conversion
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本研究通过过表达大肠杆菌内源转氢酶基因sthA和ATP合成酶基因atpAGD，显著提升甲烷同化效率，并应用于3-羟基丙酸和三乙酸乳酸酯的生物合成，在混合碳源条件下实现2014 mg/L的高产，验证了其工业化应用潜力。
刘海燕|朱成|陈云|谭在高等
上海交通大学微生物代谢国家重点实验室，上海，200240，中国
摘要
甲醇来源于丰富的天然气、沼气、煤气化、生物质转化和二氧化碳还原过程，是一种有前景的生物化学品生产底物，因此其吸收机制成为本研究的重点。在本研究中，为了提高大肠杆菌（Escherichia coli，简称E. coli）对甲醇的吸收效率，我们增加了细胞内的ATP和NADPH供应，显著改善了细胞代谢，从而提高了甲醇的利用效率。首先分别过表达了内源性转氢酶基因sthA和ATP合成酶基因atpAGD，结果sthA的甲醇吸收效率提高了15倍，atpAGD的甲醇利用效率提高了21倍。随后，通过筛选不同的RBS序列组合来共同表达sthA和atpAGD，进一步将工程菌株的甲醇利用能力提高了28倍。此外，分析了细胞内ATP、NADH和NADPH的水平，发现ATP水平显著升高，而NADH水平下降并在整个培养过程中持续降低。相比之下，NADPH水平逐渐升高。这些发现表明，甲醇代谢需要增加ATP和NADPH的供应以减轻细胞代谢压力。最后，利用这种共表达的工程菌株进行了3-羟基丙酸（3-HP）和三乙酸内酯（TAL）的生物合成。值得注意的是，在没有额外代谢修饰的条件下，该工程菌株在甲醇和木糖混合作为碳源的情况下，3-HP的产量达到了2014 mg/L，显示出其显著的工业应用潜力。
引言
由于全球环境问题日益严重，可持续发展已成为保护人类生存所需栖息地的关键责任和目标（Jiang等人，2021；Lv等人，2023）。与传统化学提取过程相比，微生物生物转化用于化学品生产可以有效减少碳排放，符合当前绿色和可持续发展的目标（Kover等人，2021）。随着代谢工程和合成生物学的不断发展，微生物生产底物正从食品来源的糖类转向非食品资源，以避免与人类食物供应竞争（Wang等人，2023）。其中，工业废木质纤维素水解物已成为一种有前景的替代品。然而，复杂的预处理过程和木质纤维素的固有毒性使得微生物难以高效利用它。因此，研究人员转向了更具成本效益且易于获得的低碳化合物，包括甲醇（CH?OH）、甲酸（HCOOH）、二氧化碳（CO?）和一氧化碳（CO）作为工业生产的非糖类原料（Lv等人，2023）。
甲醇是一种丰富的工业化学品，可以方便地以液态储存，并可通过天然气或其他可再生资源（如二氧化碳氢化）生产（Du等人，2016）。甲醇的生产过程和较高的储存能力有助于降低其作为碳源的生物制造成本。此外，甲醇比葡萄糖更容易被还原，可能支持更高的产量。基于这些优势，甲醇有望成为生产高附加值产品的微生物细胞工厂的首选碳源（Whitaker等人，2015）。Vorholt等人改造了大肠杆菌（E. coli），使其能够以甲醇为唯一碳源生长（倍增时间为4.3小时），并展示了乳酸、聚羟基丁酸（PHB）、衣康酸和对氨基苯甲酸（PABA）的生产（Reiter等人，2024）。Ledesma-Amaro等人将Yarrowia lipolytica转化为用于白藜芦醇合成的甲基营养型底盘（Jiang等人，2025）。Zhou等人通过实验室驯化使Ogataea polymorpha能够在甲醇基脂肪酸生产中存活，实现了15.9 g/L的产量（Gao等人，2022）。Wang等人开发了用于Bacillus methanolicus的基因编辑工具，并对其进行了L-精氨酸生产的工程改造（Liu等人，2025b）。
天然存在的甲基营养型微生物，如Pichia pastoris、Methylobacillus methanoliticus和Methylorubrum extorquens，可以直接利用甲醇；然而，它们的生长速度较慢，遗传操作具有挑战性（Sauvageau等人，2024）。因此，研究人员将重点转向了更易于处理的非甲基营养型生物，如大肠杆菌（E. coli）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），并通过基因工程改造使其能够利用甲醇作为碳源（Espinosa等人，2020；Keller等人，2020；Woolston等人，2018）。2015年，研究人员通过表达Mdh（甲醇脱氢酶）、Hps（己糖磷酸合成酶）和Phi（磷酸己糖异构酶）使大肠杆菌能够利用甲醇，将其转化为中间产物6-磷酸己糖。此后，关于大肠杆菌中甲醇吸收的研究取得了进展（Muller等人，2015）。
微生物细胞需要持续的代谢能量（ME）供应，包括ATP和还原 equivalents，以支持基本的生理功能。这些功能包括营养物质的获取、细胞生长、生物生产、代谢产物的分泌以及抵抗环境压力的能力。维持ME的稳态对于确保微生物系统中这些复杂代谢活动的正常运作至关重要（Tong等人，2021）。细胞生命活动依赖于能量，能量主要以ATP的形式储存，ATP常被称为细胞的“能量货币”（Liang，2025）。ATP主要通过糖酵解和氧化磷酸化途径合成，为细胞功能提供必要的能量（Rigoulet等人，1982）。高效的ATP合成对于维持细胞稳定性、支持生长和实现各种生理过程至关重要。细胞会根据不同的生理条件调节ATP的产生和消耗，以满足其动态能量需求（Yu和Pekkurnaz，2018）。NADH和NADPH在能量代谢和还原反应中起着关键作用。NADH主要参与电子传递链，提供ATP以满足细胞的能量需求（Chandel，2021a）。相比之下，NADPH主要参与还原反应，特别是在生物合成过程和抗氧化防御中，为脂质和核酸的合成以及维持细胞氧化还原平衡提供必要的还原力（Chandel，2021b）。
3-羟基丙酸（3-HP）被美国能源部认定为顶级平台化学品，是丙烯酸和1,3-丙二醇等化合物的前体，用于制造聚合物、塑料和树脂（Nguyen-Vo等人，2022）。通过使用葡萄糖和甘油等底物，已经探索了3-HP的生物转化途径（Liang等人，2022）。使用廉价且易获得的甲醇作为3-HP的生产底物具有很大潜力，这一领域已取得显著进展。Yang等人通过全基因组流量平衡分析（FBA）预测，将异源RuMP循环引入Methylorubrum extorquens AM1后，其生长速率提高了31.3%，3-HP的产量提高了3.1倍（Yuan等人，2021）。Zhou等人通过代谢工程策略优化了Ogataea polymorpha中的3-HP生物合成途径，增加了乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A等前体的供应，并增加了辅因子NADPH的供应，从而在摇瓶批次发酵中实现了1.45 g/L的产量（Yu等人，2023）。此外，他们还在Pichia pastoris中进行了启动子工程和其他代谢改造，实现了23 g/L的3-HP产量（Chen等人，2025）。Ferrer等人在Komagataella phaffii中应用了一系列代谢工程策略，在补料批次发酵中实现了27.0 g/L的3-HP产量（Avila-Cabre等人，2025）。
在本研究中，通过增强细胞内的还原能力和ATP供应，提高了大肠杆菌的总体代谢效率，从而提高了甲醇代谢的效率。具体来说，过表达内源性转氢酶基因sthA和ATP合成酶使甲醇的吸收效率分别提高了15倍和21倍。同时增强还原能力和ATP供应后，甲醇的利用效率提高了28倍。随后，这种具有增强甲醇代谢能力的工程菌株被用于3-HP和三乙酸内酯（TAL）的发酵，取得了有希望的结果。值得注意的是，在没有额外代谢修饰的情况下，3-HP的产量达到了2014 mg/L，这是迄今为止报道的大肠杆菌利用甲醇作为碳源的最高产量，展示了该菌株在工业应用中的潜力（Lan等人，2015；Yang等人，2017；Zhu等人，2025）。
章节片段
菌株和质粒
本研究中使用的质粒和菌株列在补充表S1和S2中。甲醇吸收质粒pCDF-CT4-1 mdh-Bm hps-Bm phi、3-羟基丙酸合成质粒pET-mcrN-mcrC和三乙酸内酯合成质粒pTrc99a-bktB是在大肠杆菌DH5α中构建的。使用大肠杆菌MG1655(DE3)作为甲醇代谢的亲本菌株，并在此基础上进行了基因改造。采用CRISPR-Cas9技术敲除了rpiA和rpiB基因。
增强还原能力供应以改善甲醇吸收
为了提高甲醇的吸收效率，我们引入了核酮糖单磷酸（RuMP）途径，其中包括来自Cupriavidus necator的甲醇脱氢酶（Mdh）（Wu等人，2016）、来自Bacillus methanolicus的3-己糖-6-磷酸合成酶（Hps）和6-磷酸-3-己糖异构酶（Phi）（pCDF-RuMP）（图1B）。为了提高甲醇的吸收效率，对先前构建的菌株进行了一系列基因改造。讨论
在大肠杆菌中，先前的研究描述了两种转氢酶的不同功能：PntAB主要生成NADPH用于生物合成，而SthA催化NADPH向NADH的转化以支持氧化磷酸化（Sauer等人，2004）。然而，在体外实验中已经证明SthA能够催化逆反应，从NADH生成NADPH（Partipilo等人，2021）。与这一公认的观点相反，我们的体内过表达实验表明
结论
甲醇是一种低成本的原料，可以通过天然气重整或二氧化碳的可再生氢还原生产（Olah，2013）。它可作为生产各种有价值化学品的前体，包括生物燃料、氨基酸和聚合物（Schrader等人，2009）。与传统的催化转化过程相比，甲醇的生物转化可能在经济条件上更具优势（Price等人，2016）。由于遗传方面的挑战
CRediT作者贡献声明
刘海燕：撰写 – 原稿、方法学、研究。朱成：方法学、研究。陈云：方法学、研究。谭在高等：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、监督、资源管理、项目管理、方法学、研究、资金获取、形式分析、概念化。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（项目编号：32422047、32371482）和上海市科学技术委员会（项目编号：24HC2810800）的财政支持。资助方未参与研究设计、数据收集与分析、发表决定或手稿的准备工作。
