《Metabolic Engineering》：Harnessing the yeast nucleus for the efficient production of valuable monoterpenes
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酵母细胞核作为亚细胞工程平台，通过整合甲羟戊酸途径和定位关键酶（如mErg20p），显著提升(+)-柠檬烯等萜烯类化合物产量。与过氧化物体协同工程后， flask-batch发酵达362.07 mg/L。
王静|曹文兵|郑兆辉|何燕|邓继良|卢晓聪|沈俊峰|杨晓宇|刘艳辉|肖石|陶宇|唐洪婷
中山大学深圳校区农业与生物技术学院，中国广东省深圳市518107
摘要：
亚细胞工程作为一种关键策略，被用于放大酵母细胞工厂中的萜烯生产。酵母细胞核与细胞质共享乙酰辅酶A池，并在有丝分裂过程中保持核膜的完整性，这为亚细胞工程提供了独特的区室化能力。尽管具有这些特性，但目前仍缺乏利用酵母细胞核潜力进行亚细胞工程的研究。在这项研究中，我们将酵母细胞核开发为一个新型平台，利用亚细胞区室的优势来高效生产有价值的化学物质。由于前体香叶基二磷酸与细胞质异戊二烯生物合成之间的内在耦合，微生物生产单萜类化合物仍然面临重大障碍。通过引入甲瓦龙酸途径，有效利用细胞核中的乙酰辅酶A池后，几种具有商业价值的单萜类化合物的生产水平得到了提升。此外，我们证明了将核工程与其他亚细胞区室结合使用可以协同增加产量。通过对细胞核和过氧化物酶体的组合改造，在含有2%半乳糖的摇瓶批次发酵中，(R)-(+)-柠檬烯的产量比仅使用过氧化物酶体时增加了303%，达到362.07毫克/升。这项研究表明，细胞核可以成为高效生产有价值化合物（尤其是那些由乙酰辅酶A衍生的化合物）的强大平台。
引言
通常在细胞质中构建的合成途径被用于微生物生产高价值化合物（Hammer和Avalos，2017）。然而，由于不利的反应环境、代谢物毒性和来自天然代谢途径的竞争，这些途径有时会导致产量较低。这些天然途径经过进化，具有高度的结构和调控机制，常常导致中间产物的消耗和不希望出现的调控效应（Nielsen和Keasling，2016）。为了保护代谢途径免受细胞质中竞争性反应的影响，真核生物自然利用了亚细胞区室。这些区室可以防止竞争性途径之间的相互作用，创造有利的反应条件，并集中底物和酶，从而提高效率和生产力（Zecchin等人，2015）。受这种自然方法的启发，亚细胞工程在有效生产有价值产品方面受到了越来越多的关注（Hammer和Avalos，2017）。
单萜类化合物是一大类天然化合物，在食品、化妆品、燃料和可再生聚合物行业中得到广泛应用（Ignea等人，2014）。目前从植物中提取单萜类化合物或通过化学合成方法生产的方法难以满足不断增长的需求和可持续性标准。因此，微生物细胞工厂为它们的生产提供了一个有吸引力的替代方案（Lei等人，2021；Mahmoud和Croteau，2002）。在探索用于此目的的各种微生物中，Saccharomyces cerevisiae因其生产单萜类化合物的潜力而受到广泛关注，包括(R)-(+)-柠檬烯（Kong等人，2023；Zhang等人，2021）、香叶醇（Jiang等人，2017；Yee等人，2019）、(S)-(-)-柠檬烯（Dusséaux等人，2020）、莰烯（Dusséaux等人，2020）、α-蒎烯（Dusséaux等人，2020）。单萜类化合物的合成通过单萜类合成酶实现，这些酶以香叶基二磷酸（GPP）为前体，而GPP是通过甲瓦龙酸（MVA）途径从乙酰辅酶A合成的。然而，在S. cerevisiae的细胞质中实现这些一步生物合成反应面临挑战，因为GPP会与天然的甾醇生物合成途径竞争。在酵母中，GPP迅速转化为法尼基二磷酸（FPP）以促进甾醇的生产，这对细胞生长至关重要。双功能合成酶Erg20p在将异戊二烯二磷酸（IPP）和二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP）转化为GPP，随后转化为FPP的过程中起着关键作用。这种GPP向甾醇生物合成的分流导致用于合成途径的流量不足，从而降低了GPP衍生产品的产量。
为了解决这一限制，几种策略，特别是亚细胞工程，已经引起了人们对生产GPP衍生化合物的极大兴趣（Cao等人，2020；Duran等人，2020；Ignea等人，2014；Ignea等人，2019）。线粒体是负责通过丙酮酸氧化产生细胞能量的重要细胞器，为合成途径提供了丰富的乙酰辅酶A来源。值得注意的是，将倍半萜类合成酶靶向线粒体显著提高了戊烯和阿莫尔法迪烯的产量（Farhi等人，2011；Yuan和Ching，2016）。将香叶醇生物合成途径引入线粒体后，香叶醇的产量比具有细胞质途径的菌株增加了6倍（Yee等人，2019）。过氧化物酶体是脂肪酸降解产生乙酰辅酶A的细胞器，也被改造用于提高α-葎烯的产量。过氧化物酶体和细胞质的组合工程使α-葎烯的产量相对于仅具有细胞质途径的菌株增加了2.5倍（Zhang等人，2020）。最近，过氧化物酶体被用作高效合成GPP衍生化合物（包括单萜类化合物、单萜类吲哚生物碱、三萜类和大麻素）的平台（Dusséaux等人，2020；Ma等人，2024）。这使得单萜类化合物的产量显著增加，与S. cerevisiae的细胞质生产相比提高了125倍（Dusséaux等人，2020）。这些研究表明，亚细胞工程是生成GPP衍生化合物的一种非常有效的策略。
在S. cerevisiae中，乙酰辅酶A（GPP的前体）主要分布在四个亚细胞区室中，包括细胞质、线粒体、过氧化物酶体和细胞核。虽然细胞质、线粒体和过氧化物酶体已被成功开发为平台，但细胞核尚未得到充分探索。重要的是，与其他真核生物不同，酵母细胞核具有功能性的区室化，在有丝分裂过程中保持核膜的完整性（Taddei和Gasser，2012）。细胞核是真核细胞中的一个膜包裹的区室，其中包含染色体，可以促进底物和酶的局部集中。组蛋白乙酰化是染色体成分的关键后修饰过程，控制着基本的细胞功能，包括转录、复制、DNA修复、细胞周期进展和衰老（Galdieri等人，2014）。所有已知的蛋白质乙酰转移酶都使用乙酰辅酶A作为乙酰化供体，导致乙酰辅酶A在细胞核中积累，从而调节基因表达（Shi和Tu，2015）。进一步的研究强调了酵母中核和细胞质乙酰辅酶A池之间的功能相互作用（Sivanand等人，2018）。Takahashi H等人证明，将乙酰辅酶A合成酶定向到细胞质或细胞核都足以维持组蛋白乙酰化（Takahashi等人，2006）。此外，通过抑制乙酰辅酶A羧化酶活性来减少乙酰辅酶A在脂肪酸合成中的使用已被证明可以增强组蛋白乙酰化（Galdieri和Vancura，2012；Zhang等人，2013）。这些发现表明，持续的乙酰辅酶A流入细胞核可能是为了满足生物合成途径的需求。此外，细胞核还配备了ATP，这对能量密集型酶的染色质重塑至关重要，以及NADPH，它在还原性生物合成和抗氧化防御中起着关键作用（Dzeja等人，2002；Eun等人，2019；Ju等人，2020；Rinnerthaler等人，2012；Srinivas和SLAVI，2018；Wright等人，2016）。鉴于这些有利特性，研究细胞核是否可以作为生产乙酰辅酶A衍生产品的平台是很有趣的。
在这项研究中，我们使用酵母细胞核作为生产各种单萜类化合物的平台（图1）。最初，我们选择了(R)-(+)-柠檬烯来验证这一概念。当(R)-(+)-柠檬烯合成酶和FPP合成酶变体Erg20p（F96W，N127W，命名为mErg20p）位于细胞核中时，观察到(R)-(+)-柠檬烯的产生量增加了6.89倍。此外，我们将完整的MVA途径引入细胞核，将细胞核中的乙酰辅酶A转化为GPP，从而显著提高了(R)-(+)-柠檬烯的产量。此外，我们利用细胞核高效生产了多种单萜类化合物，包括(S)-(-)-柠檬烯、α-蒎烯、莰烯和香叶醇。最后，我们对细胞核和过氧化物酶体进行了组合改造，进一步提高了(R)-(+)-柠檬烯的产量，在含有2%半乳糖的摇瓶培养中达到了362.07毫克/升。我们的发现表明，核工程是一种可行的策略，用于生产乙酰辅酶A衍生化合物，并且可以与其他亚细胞区室结合使用以进一步提高产量。
化学标准和试剂
(R)-(+)-柠檬烯（Sigma-Aldrich，62118）、(S)-(-)-柠檬烯（Sigma-Aldrich，62128）、莰烯（Sigma-Aldrich，456055）、α-蒎烯（Sigma-Aldrich，147524）、莰烯（Sigma-Aldrich，W530597）和十二烷（Sigma-Aldrich，D221104）从Sigma-Aldrich（上海）贸易有限公司购买。香叶醇（TCI，G0027）从TCI（上海）开发有限公司购买。Phanta? Max Super-Fidelity DNA聚合酶（Vazyme，P515）和Rapid Taq Master Mix（Vazyme，P222）从Vazyme购买
单萜类化合物核生产的概念验证
为了评估使用细胞核作为生产平台的可行性，我们选择了(R)-(+)-柠檬烯作为目标分子，这是一种在香料、化妆品、制药和燃料中广泛使用的高价值化合物（Jongedijk等人，2016）。对于核生产，我们表达了Citrus limon (R)-(+)-柠檬烯合成酶ClLimS（Dusséaux等人，2020），这种酶具有高产物特异性（表S6），并且在其C末端具有SV40核定位信号（NLS）。表达是由强
讨论与结论
富含乙酰辅酶A的酵母细胞核是许多有价值化合物生物合成的关键区室，但在代谢工程中尚未得到充分利用。以往关于单萜类化合物生物合成的研究主要集中在线粒体和过氧化物酶体上，利用这些区室来防止GPP在细胞质中快速降解并提高产量（Dusséaux等人，2020；Yee等人，2019）。在这项研究中，我们成功地将酵母细胞核作为一个平台
CRediT作者贡献声明
郑兆辉：撰写——原始草稿、方法学、正式分析、数据管理。曹文兵：撰写——原始草稿、方法学、研究、正式分析、数据管理。卢晓聪：方法学。沈俊峰：方法学。邓继良：撰写——审阅与编辑。何燕：方法学。肖石：撰写——审阅与编辑。王静：撰写——原始草稿、方法学、研究、正式分析、数据管理。刘艳辉：概念化。杨晓宇：方法学，致谢
本工作得到了国家重点研发计划（编号2021YFA0911000）、国家自然科学基金（编号32471484；32522003；32200072）、绿色生物制造国家重点实验室开放项目（编号SKLGBMOPG20250001）、深圳市科技计划（编号JCYJ20240813151051065）和中国科学院战略优先研究计划（编号XDB0480000）的财政支持。我们还要感谢额外的
