《Biochemistry》：Dissecting the Binding Interactions of the Chromatin Remodeler SMARCA4 with G-Quadruplex DNA
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这篇研究通过生物物理手段，揭示了染色质重塑关键因子SMARCA4特异性、高亲和力识别多种拓扑结构的G-四链体(G4) DNA的分子机制，其结合主要由D1 (DExx-c) 解旋酶结构域介导，且具有较长的停留时间，为理解G4在基因组功能调控中的作用提供了新视角。
引言
DNA G-四链体(G-quadruplexes, G4s)是由鸟嘌呤四联体通过Hoogsteen键堆叠并由单价阳离子稳定形成的非经典四链结构。它们是染色质的关键特征，调控转录、表观遗传状态和基因组稳定性等多种细胞过程。G4s可作为蛋白结合枢纽，招募包括转录因子(如SP1)和染色质重塑组分(如SMARCA4)在内的多种染色质相互作用蛋白。G4与蛋白相互作用的分子细节仍在探索中，其结合模式可分为环结合、沟结合和四联体结合三类。尽管已鉴定出许多G4结合蛋白，但对这些相互作用的分子基础理解仍有限。染色质重塑因子是其中重要的一类，SMARCA4是SWI/SNF染色质重塑复合物的关键催化ATP酶亚基，通过核小体弹出或重新定位驱动染色质重塑。SMARCA4的解旋酶结构域突变与包括癌症在内的多种疾病相关。先前研究已通过蛋白质组学、ELISA和下拉实验证实SMARCA4与G4s存在相互作用，且SMARCA4结合位点与基因组中折叠的G4特征有重叠。
SMARCA4具有多个具有核酸结合特性的结构域，包括解旋酶/ATPase结构域、AT-hook基序和溴结构域。解旋酶结构域由两个RecA样结构域组成：DEAD样解旋酶超家族C端结构域(D1, DExx-c)和螺旋酶超家族C端结构域(D2, HELIC-c)，中间被一个插入片段隔开，已知其负责将SMARCA4锚定在染色质化DNA上。AT-hook位于蛋白N端距溴结构域十个残基处，先前研究表明AT-hook和溴结构域复合体(AT-BRD)能以低至中等微摩尔亲和力以多价方式结合双链DNA。溴结构域通常以结合乙酰化组蛋白而闻名，对组蛋白H3第14位赖氨酸乙酰化(H3K14Ac)有偏好，但也已被证明可结合dsDNA。AT-hook先前已被证明可结合RNA。理解SMARCA4如何识别G4结构有助于深入了解此相互作用的功能作用，并进一步理解其机制意义。
材料与方法
解旋酶小叶D1被克隆到pMAL-c6T载体中，并表达为N端MBP融合构建体，在BL21 DE3细胞中于37°C培养至OD值达到0.5-0.6，用0.5 mM IPTG诱导并于20°C过夜孵育。AT-hook-溴结构域被克隆到pGEX-6P-1质粒中，并表达为N端GST融合蛋白，随后被切割。全长SMARCA4购自AscentGene，带有N端His标签。用于研究的寡核苷酸购自Sigma-Aldrich。G4和单链突变体DNA在10 mM Tris和100 mM KCl pH 7.4中退火。双链DNA的正向链及其反向互补链以1:1比例在10 mM Tris和100 mM NaCl pH 7.4中退火。所有寡核苷酸在95°C加热5分钟，然后逐渐冷却至20°C。使用圆二色光谱分析寡核苷酸结构。所有生物层干涉测量结合实验均在OCTET RED96仪器上于25°C进行，将100 nM生物素化寡核苷酸加载到链霉亲和素生物传感器上。
结果与讨论
SMARCA4对不同G4拓扑结构具有选择性高亲和力结合
为构建SMARCA4-G4相互作用的分子动态图景，研究设定了三个目标：阐明该相互作用对G4结构的选择性及对不同拓扑结构的偏好；探究SMARCA4在G4上的停留时间；理解SMARCA4–G4相互作用的分子识别。首先，研究检测了SMARCA4对G4结构的亲和力及其对不同G4拓扑结构的偏好。G4由于链方向的不同组合可形成平行、反平行或混合等多种拓扑结构。研究选用了已知的G4形成合成寡核苷酸，包括三个平行G4s(Kit1 G4, Pu27 G4, VEGF G4)、一个反平行G4(Kit* G4)和一个混合G4(BCL2 G4)。圆二色光谱证实这些序列在体外可形成G4结构。随后使用生物层干涉测量法测量SMARCA4与折叠G4s的结合。所有测试的G4s均以相似的低纳摩尔亲和力结合重组全长SMARCA4，对平行G4s有轻微偏好(例如KIT1 G4的KD为7.39 ± 3.6 nM)。BLI还提供了结合动力学测量，显示高亲和力是由慢解离速率(koff，约10–4至10–5s–1)驱动的，这相对于大多数蛋白质-核酸相互作用而言是较慢的。
为理解G4s是否是SMARCA4在基因组中的优先结合位点，研究评估了SMARCA4对折叠G4 DNA与无法折叠成G4结构的单链DNA对照的选择性结合。ssDNA对照通过将关键鸟嘌呤碱基替换为胸腺嘧啶以防止Hoogsteen键形成，或替换为异构体8-氮杂-7-脱氮鸟嘌呤以阻止Hoogsteen键和G4形成。BLI测量显示，SMARCA4选择性结合G4结构而非ssDNA对照，对G4的偏好性高出3至10倍。研究还评估了SMARCA4区分折叠G4结构与双链DNA对照的能力。仅观察到与dsDNA的最小结合，其亲和力至少比G4结构弱10倍。这些结果共同表明G4s是SMARCA4相互作用的关键核酸特征。
G4环在SMARCA4结合中的作用
基因组中的G4结构在四联体之间可以具有不同长度的连接环。为探究SMARCA4是否根据环长区分G4s，研究评估了SMARCA4与一系列不同环长的G4s的结合。天然G4s的环长各不相同，最长的环含有三(Kit* G4)、四(VEGF G4)、五(Kit1 G4)、六(Pu27 G4)和七(BCL2 G4)个碱基。研究还探索了仅具有极短环的影响，使用了先前报道的环中仅有一或两个胸腺嘧啶的合成G4寡核苷酸(G3T和G3T2)。BLI测量发现，G3T和G3T2对SMARCA4具有相似的低纳摩尔结合亲和力，与具有较长环的其他天然G4s相比无显著差异。在天然G4s中，环的长度对亲和力也没有明显影响。这些结果表明G4的环在驱动SMARCA4结合中不起主要作用，这与主要识别G4暴露环和侧翼区域的G4相互作用蛋白核仁素不同。相反，可能存在其他结合模式，例如DHX36与四联体顶部的相互作用，或像人类POT1的原生动物类似物那样与环之间的沟区相互作用。这一结果，加上SMARCA4与不同G4拓扑结构结合亲和力的微小差异，表明SMARCA4对除核心G4结构外的特定G4特征相对无差别识别，SMARCA4很可能将G4四联体作为G4存在的关键信号，而与环长或拓扑结构无关。从生物学角度，这表明基因组中大多数折叠的G4s都可能是SMARCA4募集的潜在位点。
SMARCA4通过解旋酶结构域结合G4s
研究接下来探究SMARCA4的哪个亚结构域识别G4 DNA，因为这会影响SMARCA4如何重塑染色质。SMARCA4是一个复杂的多结构域蛋白，其中多个结构域被认为可与核酸相互作用。研究聚焦于AT-hook与溴结构域以及解旋酶结构域的D1小叶，因为它们先前已被证明可与核酸相互作用(尽管是微摩尔亲和力)。通过BLI进行的G4结合实验显示，AT-BRD以微摩尔亲和力结合G4s，并显示出快速结合和快速解离动力学。与此形成鲜明对比的是，D1解旋酶结构域以纳摩尔亲和力结合G4s，并具有慢结合和慢解离动力学。作为对照，MBP蛋白本身不与G4s结合。这些测量结果确定D1解旋酶结构域是SMARCA4–G4相互作用的主要驱动因素，尽管其结合略弱于全长SMARCA4，表明SMARCA4中的其他区域也可能有助于结合。重要的是，无法折叠成G4s的ssDNA对照寡核苷酸对D1解旋酶结构域显示出比其对应G4s更高的KD值，表明该结构域负责SMARCA4对G4s的选择性。解旋酶结构域是G4结合的关键贡献者，这一发现进一步强调了G4-蛋白质相互作用在染色质中的重要性，先前已证明该结构域也负责将SMARCA4锚定在染色质上，并且结合该区域的长链非编码RNA被证明可抑制蛋白质功能。
结论
该研究旨在从分子层面理解SMARCA4–G4相互作用，以更好地认识其重要性和生物学作用。通过生物物理研究，发现SWI/SNF染色质重塑组分SMARCA4对G4s显示出高度选择性，对所测试的一系列不同G4结构类型具有高亲和力。研究结果强调了G4s是SMARCA4募集的关键位点，类似于SWI/SNF被不同转录因子和染色质修饰招募到不同染色质位点的方式。特别值得注意的是，观察到SMARCA4在G4结构上具有相对较长的停留时间，这归因于相对较慢的解离速率。蛋白质-DNA相互作用较长的停留时间可发挥多种作用，从促进正确位点识别到促进功能过程，再到促成稳定的转录激活或抑制。SMARCA4的长停留时间表明G4充当了一个稳定的锚，这可能影响相互作用的功能后果。同样有趣的是，观察到SMARCA4解旋酶结构域是结合G4s的主要贡献者，因为已知该结构域对于将SMARCA4锚定在染色质化DNA上至关重要。这项工作为SMARCA4–G4相互作用提供了生物物理视角，为未来研究该相互作用如何影响关键基因组机制奠定了基础。
