《Analyst》：Continuous monitoring of glutamate using electroactive templated polymers as synthetic molecular receptors
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本文介绍了一种创新的、非酶依赖性谷氨酸（Glu）电化学传感器。该传感器利用谷氨酸分子模板化的刺激响应聚合物（poly (NIPAM-VP-MAA)-g-Os(bpy)2Cl）作为合成受体，通过靶标结合诱导的聚合物构象变化（折叠/展开）产生可逆的电化学信号（SWV）。该传感器在人工脑脊液（ACSF）和小鼠血清中实现了高选择性、约1分钟时间分辨率的谷氨酸实时监测，为研究神经精神疾病中的谷氨酸能信号传导提供了极具潜力的新工具。
谷氨酸（Glu）是中枢神经系统中最重要的兴奋性神经递质，广泛参与学习、记忆、长时程增强和突触可塑性等关键脑功能。越来越多的证据表明，谷氨酸能信号传导功能障碍与多种神经和精神疾病的病理生理过程密切相关，包括癫痫、阿尔茨海默病、帕金森病、精神分裂症，甚至药物成瘾和癌症进展。因此，在脑组织中实现对谷氨酸的准确、可靠、高时空分辨率的监测，对于深入理解其在细胞水平的传输机制、功能以及对精神健康状况的影响至关重要。然而，实现这一目标面临诸多挑战，主要原因是缺乏能够同时提供高靶标选择性和连续测量能力的谷氨酸结合受体。现有技术如全细胞膜片钳、微透析、酶促生物传感器和基因编码光学传感器（如iGluSnFR）等，各自在化学选择性、时空分辨率、长期稳定性或检测范围方面存在局限。
为应对这些挑战，本研究开发了一种基于聚合物的新型电化学生物传感器，旨在显著提升对谷氨酸的选择性检测能力。该传感器的核心创新在于采用了一种模板化聚合物（poly (NIPAM-VP-MAA)-g-Os(bpy)2Cl）作为合成分子受体。该聚合物在合成过程中以N-甲基-L-谷氨酸（N-mGlu，因其在溶剂中溶解性优于L-Glu而被用作模板）为模板，从而在聚合物链上形成了对谷氨酸分子具有高亲和力的特异性结合位点。聚合物链上接枝的锇（Os）络合物作为氧化还原标签。其检测机制依赖于靶标（谷氨酸）结合诱导的聚合物构象变化：在特定缓冲环境（如人工脑脊液ACSF）中，无靶标时聚合物保持折叠构象，使氧化还原标签靠近电极表面，从而产生较强的方波伏安法（SWV）峰电流（信号开启状态）；而当谷氨酸与聚合物结合时，会触发聚合物从折叠态向展开态的转变，导致氧化还原标签远离电极表面，SWV峰电流随之降低（信号关闭状态）。这种可逆的结合动力学使得传感器能够实现谷氨酸的连续检测，时间分辨率可达约1分钟，在ACSF中的检测限低至88.5 nM。
聚合物表征与结合亲和力验证
通过核磁共振（NMR）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）和凝胶渗透色谱（GPC）等手段确认了聚合物的成功合成及其分子特性。表面等离子体共振（SPR）分析进一步定量评估了聚合物对模板分子N-mGlu的结合亲和力。结果表明，模板化聚合物对N-mGlu的解离常数（KD）为0.95 μM，显著优于非模板化聚合物的5.85 μM，有力证明了分子模板化过程有效增强了聚合物对靶标（及其结构类似物）的特异性识别能力。
在ACSF和小鼠血清中的电化学检测性能
在生理相关缓冲液ACSF中，该传感器对谷氨酸表现出浓度依赖性的“信号关闭”响应，检测线性范围在10 nM至500 nM之间。重要的是，传感器在面对其他可能干扰的神经化学物质，如γ-氨基丁酸（GABA）、甘氨酸和天冬氨酸时，展现出了对谷氨酸的高选择性，尽管对GABA存在一定程度的交叉反应，这可能源于二者分子结构的相似性。为了验证传感器在真实生物样本中的实用性，研究进一步在小鼠血清中进行了测试。结果同样观察到了浓度依赖性的信号响应，且SWV曲线在血清中比在ACSF中更为稳定，这归因于血清具有更优异的pH缓冲能力。这些结果共同证明了该传感器平台在复杂生理环境中检测谷氨酸的可行性。
信号机制的频率与离子依赖性
研究还深入探讨了传感器信号机制的复杂性。首先，信号响应模式（“信号开启”或“关闭”）不仅受靶标结合影响，还与测量所用SWV的频率密切相关。实验发现，在低频率（1-5 Hz）下，传感器对谷氨酸的响应表现为“信号开启”，而在高频率（10-100 Hz）下则转变为“信号关闭”。本研究选择5 Hz作为测量频率，以兼顾较快的采样时间和足够的灵敏度。其次，缓冲液中阴离子的类型（霍夫迈斯特效应）对聚合物初始构象有决定性作用。在离液序列较高的高氯酸盐（ClO4-）缓冲液中，聚合物初始呈展开态，靶标结合导致其折叠，产生“信号开启”响应；而在ACSF这种含有较多易水化离子（促水结构离子）的缓冲液中，聚合物初始为折叠态，靶标结合使其展开，从而产生“信号关闭”响应。这表明传感器的检测机制高度依赖于其工作环境的化学组成。
谷氨酸的连续实时监测
为评估传感器在动态环境中的性能，研究进行了连续实时监测实验。通过顺序滴加不同浓度（0, 1, 20, 100, 200, 500 nM, 1 μM）的谷氨酸ACSF溶液，并连续记录SWV峰电流，传感器成功追踪了谷氨酸浓度的阶跃变化。尽管在浓度变化后达到稳定响应需要约1分钟的时间（可能源于聚合物形态调整或电极表面聚合物链间的相互作用），但这初步证明了其用于实时监测的潜力。在连续测量模式下，传感器对甘氨酸和天冬氨酸的响应可忽略不计，对GABA虽有轻微响应，但幅度远低于相同浓度的谷氨酸，再次印证了其良好的选择性。
结论与展望
本研究成功开发了一种基于刺激响应性模板聚合物的非酶促谷氨酸电化学生物传感器。该传感器利用靶标结合诱导的聚合物构象变化产生电化学信号，在生理相关环境（ACSF和小鼠血清）中实现了对谷氨酸的高选择性、可逆和接近实时的检测。虽然目前其时空分辨率相较于膜片钳、iGluSnFR等成熟技术尚有差距，但该平台因其简单的设计和架构，通过进一步的器件微型化、聚合物表面覆盖度精确控制以及结合先进的机器学习算法进行信号处理，具有显著提升性能的潜力。这项工作为在生理模型中直接、持续监测谷氨酸浓度动态变化提供了一种有前景的新工具，未来可进一步发展为植入式线型探针，用于脑切片或活体组织的神经化学原位分析，为神经科学研究和神经精神疾病的机理探索与诊疗监测开辟新途径。
